海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素的生物合成

孔 青，劉奇正，耿 娟，王秀丹，于方塘

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003;2.山東省出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東青島266005)

海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素的生物合成

孔 青1，劉奇正1，耿 娟2，王秀丹1，于方塘1

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003;2.山東省出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東青島266005)

從海洋中分離篩選出一株巨大芽孢桿菌，在PDA平板上此株巨大芽孢桿菌可以顯著抑制黃曲霉的生長，進而重點研究其對黃曲霉毒素合成的影響。結果表明，在液體培養基中此株海洋巨大芽孢桿菌極顯著地抑制黃曲霉產黃曲霉毒素(p＜0.01);另外研究發現，在受機械損傷的花生上，此株巨大芽孢桿菌也可顯著抑制黃曲霉毒素的生物合成(p＜0.05);而在沒有機械損傷的花生上，此株芽孢桿菌沒能表現出抑制毒素合成的能力。抑制機理初步認為，該株海洋巨大芽孢桿菌通過競爭性生長和產生某種次級代謝產物，抑制黃曲霉的生長和黃曲霉毒素合成基因的表達。

巨大芽孢桿菌，抑制，黃曲霉，黃曲霉毒素

Abstract:A strain of marine Bacillus megaterium was screened from the ocean.This strain of B.megaterium exhibited high inhibitory effect on the growth of Aspergillus flavus on PDA plates，so the inhibitory effect on the biosynthesis of aflatoxin was further studied.The results showed this strain of B.megaterium could significantly inhibit the biosynthesis of aflatoxin both in liquid medium(p＜0.01)and mechanical damaged peanuts(p＜0.05)，but didn’t exhibit inhibitory biosynthesis effect in intact peanuts.The primary inhibitory mechanisms were accredited to competitive growth and some kinds of metabolites secreted by this strain of B.megaterium which could inhibit the growth of A.flavus and expression of the genes relating to aflatoxin biosynthesis.

Key words:Bacillus megaterium;inhibition;Aspergillus flavus;aflatoxin

黃曲霉毒素是一大群結構十分相似的曲霉的次生代謝產物，包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素 M1(AFM1)、黃曲霉毒素 M2(AFM2)等18種之多，目前已證實能產生黃曲霉毒素(aflatoxin)的菌株主要是曲霉屬的黃曲霉(Aspergillus flavus Link)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus Speare)［1］。大量的實驗數據表明，黃曲霉毒素可使人類和多種動物誘發實驗性肝癌，是目前已發現的最強的化學致癌物。我國是世界上最大的花生出口國，出口量占國際出口總量的三分之一，但是黃曲霉毒素是當前花生等糧食作物出口面臨的最大技術性難題，也是2006年以來我國花生出口量持續下降的主要原因。所以，篩選出既可以抑制黃曲霉生長和毒素合成，又不會對花生等糧食作物產生二次污染，即安全無毒的抗黃曲霉微生物或功能因子，具有很大的開發潛力和研究價值。近幾年，隨著海洋生物技術的發展，從海洋生物中提取的抗菌活性物質層出不窮。覆蓋地球表面積71%的海洋是生命的發源地，其生物多樣性遠遠超過陸地;另外，海洋環境具有與陸地環境顯著不同的特征，如高壓、低營養、低溫、無光照以及局部高溫、高鹽等所謂的生命極限環境，海洋微生物適應了海洋獨特的生活環境，必然造就其獨特的代謝途徑和遺傳背景，生物學特性有別于陸地微生物，具有產生抑制黃曲霉毒素生物合成的活性物質的巨大潛力［2－4］。目前，實驗室已從黃海中分離篩選出一株抑制黃曲霉活性高的微生物，利用16S rDNA特異性擴增技術結合形態特征、生理生化實驗對其菌種鑒定，結果表明這是一株海洋巨大芽孢桿菌。進而研究此株海洋巨大芽孢桿菌對黃曲霉菌絲延長和孢子萌發有顯著的抑制作用，本文將重點研究此株巨大芽孢桿菌對黃曲霉毒素生物合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海洋巨大芽孢桿菌 分離自黃海，保存于中國海洋大學食品學院生物工藝實驗室，采用牛肉膏蛋白胨培養基培養;黃曲霉(Aspergillus flavus Link)山東省花生研究所單世華研究員提供，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar medium，PDA)培養;花生 市售，大小、成熟度均勻一致，無腐爛;Beacon黃曲霉毒素檢測試劑盒 美國Beacon公司。

恒溫振蕩箱 上海福瑪實驗設備有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;3－18R型高速冷凍離心機 美國TOMOS公司;Multiskan MK3型酶標儀

美國THEROM FISHER公司;恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;QHX－300BS－Ⅲ人工氣候箱 上海新苗醫療器械廠;高溫蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠。

1.2 黃曲霉毒素的定量測定

采用Beacon黃曲霉毒素檢測試劑盒進行測定。

對于液體中黃曲霉毒素的測定，每次測定直接取50μL液體按黃曲霉毒素檢測試劑盒說明書操作。

對于花生中黃曲霉毒素的測定，測定前需要做如下預處理:a.粉碎花生，然后過20目篩;b.準確稱5g粉碎的花生放入100mL蒸餾水中;c.劇烈振蕩3min;d.靜置 2～3min，使花生沉淀;e.用濾紙(Whatman GF/A)過濾，用干凈的容器收集，濾液按黃曲霉毒素檢測試劑盒說明書測定黃曲霉毒素含量。

1.3 抑制黃曲霉的生長

用無菌打孔器打直徑6mm的長有黃曲霉的瓊脂塊倒置于PDA培養基平板中央，將兩片直徑6mm的無菌濾紙片分別放于距PDA平板中心2.5cm處。實驗組在每張濾紙片上分別滴加8μL的巨大芽孢桿菌培養液(108CFU/mL)，對照組在濾紙片上滴加8μL無菌水，實驗組和對照組各重復五個PDA平板，37℃恒溫培養箱中培養 6d［5］。

1.4 抑制黃曲霉毒素的生物合成

106個/mL的黃曲霉孢子與108個/mL的海洋巨大芽孢桿菌混合培養于 PDA液體培養基中(含106個/mL的黃曲霉孢子的PDA液體培養基為對照)，28℃下搖床培養7d，每天用Beacon黃曲霉毒素檢測試劑盒檢測黃曲霉毒素含量。此實驗重復3次。

1.5 抑制黃曲霉毒素在花生上的生物合成

取80個花生，在0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒1min，自來水沖洗干凈，自然風干后分成A(不打孔孢子)、B(不打孔混菌)、C(打孔孢子)、D(打孔混菌)四組，每組20個花生。C、D組的花生用無菌打孔器打出直徑6mm，深約3mm的小孔。將A、C組的花生浸泡在黃曲霉孢子(106個/mL)溶液中侵染1min;將B、D組的花生浸泡在海洋巨大芽孢桿菌(108CFU/mL)和黃曲霉孢子(106個/mL)的混合液中侵染1min。將侵染后的A、B、C、D四組花生分別放入人工氣候箱，控制溫度28℃、相對濕度90%，培養7d后用Beacon黃曲霉毒素檢測試劑盒檢測各組花生中的黃曲霉毒素含量。此實驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 抑制黃曲霉的生長

海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉生長的結果見圖1，濾紙片周圍有白色芽孢桿菌菌落，黃曲霉生長受到明顯抑制(平板兩側的菌體是巨大芽孢桿菌;中間黃綠色的是黃曲霉);而對照組中黃曲霉長勢良好，菌落布滿整個平板。此實驗結果表明，海洋巨大芽孢桿菌對黃曲霉的生長有明顯抑制作用。

圖1 巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉的生長

2.2 抑制黃曲霉毒素的生物合成

海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素合成的結果見圖2，由圖2可知，在第0d，液體培養基中的黃曲霉毒素含量在7ppb左右;但在培養的第1d，對照組(黃曲霉孢子)中的黃曲霉毒素含量迅速上升到101.07±4.16ppb，實驗組(黃曲霉孢子和巨大芽孢桿菌)中的黃曲霉毒素含量上升到40.64±8.76ppb，巨大芽孢桿菌顯著抑制了黃曲霉毒素在PDA液體培養基中的合成(p＜0.01);在培養的第2d，對照組中的黃曲霉毒素含量上升到112.36±5.17ppb，此后隨著培養天數的增加，黃曲霉毒素含量并沒有增加而保持相對穩定，說明此株黃曲霉主要在培養的前兩天產生黃曲霉毒素(液體培養基中);實驗組中的黃曲霉毒素含量從培養的第2d開始有所下降，在培養的第3d下降至14.66±1.52ppb，此后隨著培養天數的增加保持相對穩定，于是推測，此株海洋巨大芽孢桿菌不僅能顯著抑制黃曲霉毒素的生物合成，隨著培養時間的延長，也可以降解或破壞一定量的黃曲霉毒素，所以具有很好的應用潛力。

圖2 巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素的合成

2.3 抑制黃曲霉毒素在花生上的生物合成

由表1可以看出，A組和B組花生中的黃曲霉毒素含量沒有顯著差異，說明對于沒有機械損傷的花生，花生本身具有一定抵御黃曲霉侵染的能力，海洋巨大芽孢桿菌沒有表現出抑制黃曲霉毒素合成的能力;D組花生中的黃曲霉毒素含量顯著低于C組花生中的黃曲霉毒素含量(p＜0.05)，說明對于有機械損傷的花生，花生本身將失去部分抵御黃曲霉侵染的能力，使得黃曲霉毒素含量顯著上升(p＜0.05，與A組比較)，而此時海洋巨大芽孢桿菌表現出了抑制黃曲霉毒素在花生上生物合成的能力;C組花生中的黃曲霉毒素含量顯著高于A組花生中的黃曲霉毒素含量(p＜0.05)，也說明了機械損傷使花生抵御黃曲霉侵染的能力下降;而D組花生中的黃曲霉毒素含量低于B組花生中的黃曲霉毒素含量，推測花生受到機械損傷后，反而有利于巨大芽孢桿菌依附在花生上，從而抑制黃曲霉毒素的生物合成。

3 結論

在海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉生長的實驗中(圖1)發現，該株巨大芽孢桿菌可顯著抑制黃曲霉的生長，初步認為該株海洋巨大芽孢桿菌是通過競爭性生長和產生某種次級代謝產物來抑制黃曲霉菌絲的生長［6－7］。

在抑制黃曲霉毒素合成實驗中(圖2)，可以看出此株海洋巨大芽孢桿菌極顯著地抑制黃曲霉產黃曲霉毒素(p＜0.01);另外研究發現，在受機械損傷的花生上，此株巨大芽孢桿菌也可顯著抑制黃曲霉毒素的生物合成;而在沒有機械損傷的花生上，沒能表現出抑制毒素合成的能力(表1)。抑制機理初步認為是該株海洋巨大芽孢桿菌會抑制黃曲霉次級代謝產物調節基因和黃曲霉毒素合成基因的表達，如LaeA、aflR、aflS 等［7－8］。本項目小組將繼續深入研究該株海洋巨大芽孢桿菌對黃曲霉毒素生物合成調節基因表達的影響，以更準確全面地闡明該株海洋巨大芽孢桿菌對黃曲霉毒素合成影響的本質。

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Inhibitory effect on the aflatoxin biosynthesis by a strain of marine Bacillus megaterium

KONG Qing1，LIU Qi－zheng1，GENG Juan2，WANG Xiu－dan1，YU Fang－tang1
(1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China;2.Inspection and Quarantine Technical Center of Shandong Exit＆ Entry Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266005，China)

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0132－03

2009－08－31

孔青(1979－)，男，博士，講師，研究方向:農產品安全。

青島市科技發展計劃(081324jch);國家大學生創新性實驗計劃(081042309)。