益氣活血中藥復方對CVB3大鼠心肌細胞感染模型細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ表達的影響＊

張明雪，曹洪欣，車紅花，何 偉，顧 平

（1.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032；2.中國中醫科學院，北京 100700）

本實驗采用新生2d～3d大鼠心肌細胞建立柯薩奇病毒B3（CVB3）感染模型，通過改良抑制性消減雜交技術（SSH），克隆受 CVB3攻擊的宿主細胞中被中藥（益氣活血中藥復方）調控的基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 新生2d～3d wistar大鼠，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品及制備 CVB3m嗜心肌毒株由哈爾濱醫科大學微生物實驗室提供；益氣活血中藥復方由黃芪、白參、丹參、郁金、麥冬、白茅根等藥組成，制成含生藥濃度為1g/ml的注射液，由沈陽藥科大學藥學院制備。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞的分離和培養 剪取乳鼠心室肌，用預冷 HBSS液沖洗3遍，剪為1mm3碎塊，0.25％胰蛋白酶，37℃水浴震蕩消化 50min～60min，加適量10％胎牛血清中止消化，1000r/min離心10min棄上清液，加入8ml HBSS液洗滌細胞，1000r/min離心10min棄上清液，加入含10％胎牛血清的 DMEM培養液混勻細胞沉淀，過200目濾網，經60mm培養皿純化1.5h后，將細胞分為2組，1組為病毒感染組，1組為病毒感染加益氣活血中藥復方組，于5％CO2培養箱中孵育。

1.2.2 CVB3病毒性心肌炎模型的建立［1～3］培養72h后，在已呈規律同步搏動的2組各瓶細胞中，分別加入含CVB3（在HeLa細胞上滴定CVB3病毒毒力為 10－8TCID50）的 1640生長液 1ml，吸附1.5h后一組加入10％胎牛血清1ml為 tester；另一組加以1∶16的10％胎牛血清稀釋的益氣活血中藥復方1ml為 driver，繼續培養24h后，吸出各培養瓶中的液體，用HanK氏液沖洗各組細胞，0.25％胰酶消化3min～5min，收集細胞至離心管中，1200r/min離心10min，提取 mRNA。

1.2.3 細胞mRNA的提取 mRNA的提取使用 Pharmacia公 司 的 QuickPrepRmicromRNA purification試劑盒，詳細步驟按操作說明進行，提取的總RNA于分光光度計（Backman 640）定量。

1.2.4 雙鏈cDNA的合成 采用CLONTECH公司PCR-Select TMcDNA SubtractionKit提供的試劑和酶，分別以上述 driver和 tester mRNA為模板，進行單鏈及雙鏈cDNA的合成。

SSH方法利用的寡苷核酸：以下是應用于SSH的寡核苷酸（均由 Clontech公司的PCR-select［TM］cDNA subtraction kit試劑盒提供）：ADAPTER-1：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3′，3′-GGC CGT CCA-5′；ADAPTER-2R：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAG CGT GGT CGC GGC CGA GGT-3′，3′-CGGCTCCA-5′。

第1輪 PCR引物：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGCC-3′；第2輪 PCR引物：NESTEDPCR引物1：5′-TCG AGCGGCCGC CCG GGC AGGT-3′；NESTEDPCR 引物 2R：5′-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT-3′。

1.2.5 SSH差減雜交 詳細操作過程按Clontech公司的 PCR-selectTMcDNA subtraction kit試劑盒說明書進行。利用glassmilk將PCR擴增產物即差異cDNA片斷回收并克隆到pGEM-T easy載體中，連接產物轉化XL1-Blue菌，隨機篩選30個白色克隆，挑單菌落于3ml LB培養基中，培養12h～16h，取1ml菌液用于測序，余下菌液以20％甘油 －80℃保存。

1.2.6 測序 由上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.7 GenBank序列比較 將測序結果通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/進行序列比較，尋找該片段在基因組和dbEST中是否有明顯同源的序列。

1.3 結果

1.3.1 SSH結果 以病毒組心肌細胞cDNA為tester，以病毒感染同時有益氣活血中藥復方促進的心肌細胞 cDNA為 driver，兩組 cDNA進行雜交，得到的消減雜交文庫稀釋1000倍后，作為PCR擴增的模板。PCR產物連接到pGEM-T easy載體中，進行DNA序列分析。

表1顯示，通過序列測定結果，在ncbi的blastn結合 blastx分析，得到如下結果（部分）并列于下表。

表1 利用SSH技術研究益氣活血中藥復方促進表達的基因

表2 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR擴增Ct值

1.3.2 熒光定量rt-PCR驗證結果 圖1、2和表2、3顯示，細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ基因在中藥組中的表達均比病毒組中高，說明該基因的表達可被益氣活血中藥復方上調。

圖1 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR擴增曲線圖

表3 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR擴增Ct值

圖2 Cytochrome c oxidase subunitⅡ基因rt-PCR擴增曲線圖

4 討論

病毒性心肌炎屬中醫學“溫病”、“心悸”、“胸痹”、“心痹”、“怔忡”、“虛損”等范疇。本病發病因身體素虛復感外邪所致。病位涉及心、肺、脾、胃等臟腑，其中以心為主要病位。《素問·靈蘭秘典論》曰：“心者，君主之官也，神明出焉”；《諸病源候論》云：“心藏神而主血脈，虛勞損傷血脈，致令心氣不足，因為邪之所乘，則使驚而悸動不安。”心位于胸中，主血脈，氣為血帥、血為氣母，氣行則血行，若心氣虛、運血無力，血脈運行不暢則心血瘀阻。本病病機以正虛為本，血瘀為標。有學者認為，該病后期容易耗氣并致心脈瘀阻［4］，“毒、瘀、虛”三者膠結貫穿始終；早期心肌細胞變性壞死，心肌組織缺血、缺氧、心肌間質水腫，大量的自由基堆積局部，心肌微循環障礙，此即為瘀血，故早期治療往往于方中加入活血化瘀之品［5］。益氣活血法用于病毒性心肌炎的臨床治療，已得到肯定療效［6］。益氣活血中藥復方以黃芪、白參為主藥，大補元氣，固脫生津，安神。黃芪性微溫、味甘，歸肺脾經，補脾胃而建立中氣，護衛固表。藥理實驗表明，黃芪具有強心、利尿、降壓、保肝、提高免疫功能的作用，對感染病毒以及藥物中毒的心肌均有明顯的保護作用，黃芪總黃酮在病毒性心肌炎急性期可改善病毒性心肌炎引起的泵功能的損害［7～9］。白參性味甘平，歸脾、肺經，大補元氣，補脾益肺，生津養血，寧神益智。人參能增強機體免疫力，也對動物心肌無力等癥狀有改善作用［10］。丹參始載于《神農本草經》，色赤，味苦，微寒，歸心肝經，能活血化瘀、通心脈、補養心血。有實驗表明，丹參保護心肌，可促進冠狀動脈的流量，有減輕心肌缺血損傷程度和加速恢復的作用［11］。郁金歸心、肝、肺經，可行氣化瘀，清心安神為臣藥。麥冬性微寒味甘質潤，有滋陰潤肺、益胃生津、清心除煩的功效，對心血管系統與免疫系統均有良性作用［12］。白茅根味甘、性寒，入肺、胃、膀胱經，清瀉濕熱、利尿，能除伏熱、導濕熱，從小便而出，以防余熱之邪戀結體內。《神農本草經》謂其：“主治勞傷虛羸，補中益氣，除瘀血，血閉，寒熱，利小便。”二藥與黃芪、人參配伍，共奏益氣養陰之效，且甘寒之白茅根可導伏熱與濕熱下行，從小便而走；微寒之麥冬，可清解心肺客熱，恰合本病溫熱之邪易耗氣傷陰的病機特點。諸藥合用，使心氣得補，乃行血有力，血行絡通，而無留滯之患，共收益氣活血之效。本方兼以清熱養陰，與君臣藥配伍，達標本同治目的，體現了中醫學“治病求本，兼顧其標”的整體辨治理念。

心肌能量代謝障礙和心功能減退是病毒性心肌炎重要的病理生理特征。大量研究表明，VMC心功能減退與心肌細胞數量減少、結構蛋白改變、離子泵功能障礙等多種因素有關［13］。VMC急性期病毒通過心肌細胞的相關受體侵入心肌細胞，在細胞內復制、溶解細胞后得以擴散。在病毒感染過程中，吸附穿入細胞及擴散出細胞都會對細胞膜、線粒體膜造成直接損傷［14］，引起線粒體內膜上 Ca2+-ATP酶的活性下降和線粒體鈣化。病毒血癥使氧自由基生成增加及引發脂質過氧化水平增強。線粒體的含量占心肌細胞容積的35％～40％，線粒體不僅承擔著心肌90％的能量供應，且在調節細胞內 Ca2+濃度、細胞凋亡的發生等方面起著重要作用［15］。細胞色素C氧化酶（復合物 IV）是線粒體內膜的固有成分［16］，線粒體是進行三羧酸循環、氧化磷酸化的重要細胞器，其能量合成需要內膜上呼吸鏈關鍵酶——細胞色素氧化酶的參與［17］。細胞色素 C為生物氧化過程中的電子傳遞體，其作用原理為在酶存在的情況下，對組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。細胞色素 C可以在呼吸鏈復合酶Ⅲ（細胞色素還原酶）和 IV（細胞色素氧化酶）之間傳遞電子［18］。氧化態的細胞色素C可直接清除O2－，還原態的細胞色素C可清除H2O2，且線粒體的氧自由基代謝狀態與細胞凋亡之間存在因果關系［19］。細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ通常被稱為核心亞基［20］。細胞色素氧化酶亞基Ⅰ基因屬于線粒體基因，其編碼的細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ是呼吸鏈的重要組成部分［21］，且細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ是細胞色素C氧化酶的活性中心，其活性的改變導致線粒體呼吸鏈的電子傳遞受阻，并直接將電子泄漏于線粒體基質內，使超氧陰離子產生增多，導致線粒體內的氧應激水平提高［22］。

抑制性消減雜交技術是一種有效的差異表達基因分離方法，其基本原理如下：首先將兩個群體的mRNA反轉錄為cDNA，其中含有特異表達基因的樣本為 tester，另一組為 driver，tester和 driver cDNA雜交，去除雜交體 cDNA，未形成雜交體的 cDNA即是在tester中特異表達或高表達而driver中不表達或低表達的基因。抑制性消減雜交技術的優點是，因為被擴增和克隆的雙鏈 cDNA的每條鏈來源于第1次雜交的不同體系且又進行了第2次雜交，所以具有很高的特異性［23］，尤其在篩選低豐度表達基因之間的差異方面更有優越性。在本研究ssh結果中，中藥組與病毒組相比，細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ基因表達增強，其可能的機制是益氣活血中藥復方使受感染心肌細胞的細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ基因活性增加，從而提高線粒體的氧應激水平，抑制CVB3感染后細胞凋亡的發生，達到保護心肌細胞、治療病毒性心肌炎的目的，并將為病毒性心肌炎的防治提供新的理論基礎和實驗依據。

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