益氣方干預化療所致免疫功能低下作用機理的研究＊

蘇 穎，郭 焱，朱 娜，顧紅纓，李春子

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

惡性腫瘤發病率呈逐年增高趨勢，手術和放化療成為腫瘤的主要治療手段，CY是目前應用最廣泛的烷化劑類抗腫瘤藥，通過影響腫瘤細胞的生長繁殖而達到治療目的，但包括CY在內的化療藥物極易引起造血系統和免疫系統的損傷，影響惡性腫瘤的治療效果［1、2］。

腫瘤患者術后化療造成的毒副作用嚴重影響術后治療與康復，特別是血中WBC等明顯減少對機體免疫機能產生嚴重影響，因此，采取有效措施防治化療的毒副反應，越來越引起廣泛關注。而中藥能夠提高化療患者機體免疫力，對血中WBC等的生成有較好的促進作用，其研究已引起醫學界的重視［3～5］。

中藥對化療所致血中WBC等減少的治療研究，近年來取得了一定的進展，但是治療進展比較緩慢，雖有相關報道，但均處于探索階段［6～8］。

惡性腫瘤患者常伴有不同程度的正氣虛弱，免疫力較正常人低下，加之術后化療后，免疫力嚴重低下，血中紅WBC等數量嚴重不足，直接影響腫瘤術后治療及預后恢復。此種情況，運用中醫學理論辨證，雖屬氣血兩虛，但重在氣虛，氣虛不能生血為其機理關鍵。許多研究資料表明，氣血不足尤其氣虛與免疫功能的表達與調節有著重要關系［9、10］。

1 材料與方法

1.1 材料

ICR小鼠體重18g～22g，雌雄各半，由本校基礎實驗中心提供。益氣方是根據藥典配方調配，按湯劑常規煎藥、過濾。各飲片由本校附屬醫院提供。環磷酰胺，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品；EDTA-2Na，北京鼎國生物技術有限責任公司生產；小鼠GCSF試劑盒為美國BD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 取ICR小鼠，隨機分為模型組、空白對照組、益氣方高、中、低劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。實驗環境條件符GB1495-94國家標準，室溫19℃ ～21℃，相對濕度40％ ～60％，每日光照12h，自由進食飲水。

1.2.2 模型建立 給藥第8天開始給模型組、益氣方高、中、低劑量組小鼠腹腔注射環磷酰胺80mg·kg－1，連續 3d。

1.2.3 分組給藥 給藥組小鼠按劑量分別灌胃給藥，各組給藥劑量均按小鼠臨床等效量計算所得。空白對照組與模型組小鼠同時灌服等容量生理鹽水，連續15d，給藥體積為30ml/kg體重，每日給藥1次。從第8天起模型組與給藥組小鼠腹腔注射環磷酰胺80mg·kg－1，連續3d，正常組小鼠同時注射等體積生理鹽水。

1.2.4 小鼠WBC水平的測定 于第15天末次給藥20h后小鼠行鼠眼球取血，加入EDTA-Na2抗凝劑抗凝，上全自動血液分析儀分析WBC水平。

1.2.5 淋巴細胞轉化實驗（MTT法）小鼠脾細胞懸液的制備：將小鼠頸椎脫臼處死，無菌分離小鼠脾臟，置于預冷PBS中200目尼龍網研磨過濾，收集細胞，冷PBS離心（250g，5 min）洗滌細胞2次，再重懸于IMDM培養液，調整細胞密度為5×106/ml。

ConA誘導小鼠淋巴細胞增殖：將中細胞接種于96孔板，每孔200μl，分別設置對照組（只加入脾細胞和IMDM）以及不同濃度ConA刺激下的實驗組（分別加入 ConA20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml及脾細胞和 IMDM），每組含 5個復孔，孵育 42h。加入MTT5mg/ml，CO2孵育箱 6h。每孔加二甲基亞砜，充分震蕩，37℃孵育1h。570nm波長酶標儀下測OD值，計算結果。SI（刺激指標）=OD加樣孔/OD對照孔

1.2.6 小鼠粒細胞集落刺激因子（G-CSF）的測定 用ELISA法檢測小鼠外周血G-CSF水平，小鼠眼球取血，離心30min分離血清，放置 －20℃冰箱保存，進行小鼠粒細胞集落刺激因子的酶聯反應。

1.2.7 統計學分析 實驗數據用SPSS軟件進行方差分析兩兩比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對小鼠WBC的影響

通過實驗表明，注射環磷酞胺后小鼠的WBC顯著低于正常小鼠，表明其處于免疫抑制狀態。注射環磷酰胺并灌服益氣方的小鼠粒細胞數較模型組小鼠有明顯提高，尤以給予益氣方中劑量組，增加顯著，且達到正常對照水平（圖1）。提示益氣方可以抵消環磷酞胺引起的WBC減少癥狀及細胞免疫損傷，增強免疫損傷小鼠細胞的應答能力，對機體低下的細胞免疫具有一定的恢復作用。

圖1 小鼠粒細胞水平檢測

2.2 對淋巴細胞增殖的影響（MTT法）

OD值換算成刺激指數后，將模型組與空白組比較，P＜0.05，提示造模成功；高劑量組與模型組比較P=0.25＞P0.05，沒有統計學意義；中、低劑量組與模型組比較，結果P＜0.05，皆有統計學意義（圖2），說明中、低劑量給藥即可促進淋巴細胞的增殖。

2.3 對小鼠粒細胞集落刺激因子（G-CSF）的影響

實驗結果證明，模型組與空白組比較，有顯著性意義，即造模成功；益氣方高、中、低劑量組小鼠的G-CSF明顯回升，已達正常，與環磷酰胺模型組比較差異有顯著意義，高、中、低劑量進行組間比較得，益氣方中劑量治療組差異顯著性最大（圖3），提示益氣方對CY化療小鼠所致的G-CSF減少有緩解作用，并能提高G-CSF水平，提高機體的免疫力。

圖2 淋巴細胞增殖結果

圖3 小鼠粒細胞集落刺激因子（G-CSF）含量

3 討論

CY是臨床廣泛應用于惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤等惡性腫瘤的烷化劑抗腫瘤藥物，屬于細胞周期非特異性的烷化劑［11］，對整個周期中的細胞均具有殺滅作用，對腫瘤細胞和正常細胞無選擇性，在誘導腫瘤細胞生長繁殖，導致腫瘤細胞死亡和壞死，同時也能殺傷正常的組織細胞，從而對全身多種組織器官產生損傷，尤其是生長旺盛的骨髓造血細胞，因此CY很容易引起骨髓抑制，造血抑制。此外，CY也能對造血微環境造成不可逆性損傷，從而導致感染等后果，影響惡性腫瘤的治療效果［12、13］。本實驗中模型組小鼠血清G-CSF水平明顯下降，推測其原因可能為CY鼠化療造成機體廣泛性損傷而引起，而G-CSF活性的降低可能與骨髓抑制和白細胞減少，淋巴細胞轉化減少的原因之一。

益氣方湯劑主要成分為黃芪、當歸、鹿茸、阿膠、川芎、芍藥，具有益氣固表、補血活血之功。鹿茸增加鼠脊神經組織的氧消耗，使呼吸商值增加，促進糖酵解，對CY所致免疫功能低下小鼠的巨噬細胞吞噬功能均有刺激作用，對T淋巴細胞的激活有顯著作用［14］。人參明顯增加巨噬細胞的吞噬功能，對脾臟具有明顯的增重作用，是良好的強壯滋補藥。人參能促進淋巴母細胞的轉化，作用于淋巴細胞的分化成熟過程而提高T、B淋巴細胞對分裂原的反應。適當濃度人參皂甙可明顯促進淋巴細胞的有絲分裂，刺激小鼠網狀內皮系統的吞噬功能及促進補體和抗體的生成，對特異性免疫和非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫均有影響［15］，有利于機體增強免疫監視功能，抑制癌瘤細胞的核酸代謝及“封閉抗體”的形成。黃芪能提高免疫功能低下小鼠NK細胞活性，對CY化療所致的 CD3、CD4和 CD8低下能升高至接近正常。通過促進IL-2的產生而促進而改善免疫細胞的功能［16］。芍藥是活血化瘀的代表藥之一，與CY合用對S180和L615具有明顯的協同作用。

綜上所述，上述6味中藥組成的益氣方，能上調CY化療所致的免疫功能低下，改善免疫細胞的功能，提高機體免疫力。其中，中劑量治療組組效果最為顯著，高劑量治療組次之，低劑量治療組效果再次之，有關機制尚需進一步研究闡明。

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