黃河三角洲耐高滲堿性纖維素酶產生細菌YRD-19的誘變育種和產酶條件優化

桂春燕，陳義倫，*，謝曉平，董欣睿，宋 冀，吳玉雙，韓明渠，刁日明，周 波，*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；2.山東農業大學生命科學學院，山東泰安271018；3.北京匯通達科技有限公司，北京100086；4.天津牧光生物技術有限公司，天津300193）

黃河三角洲耐高滲堿性纖維素酶產生細菌YRD-19的誘變育種和產酶條件優化

桂春燕1，陳義倫1，*，謝曉平2，董欣睿2，宋 冀2，吳玉雙3，韓明渠3，刁日明4，周 波2，*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；2.山東農業大學生命科學學院，山東泰安271018；3.北京匯通達科技有限公司，北京100086；4.天津牧光生物技術有限公司，天津300193）

用紫外線對1株產耐鹽堿纖維素酶的枯草芽孢桿菌YRD-19進行誘變育種，獲得產酶能力是出發菌株5.97倍，并且產酶性能穩定的菌株YRD-19-35。進一步對其發酵條件進行研究，優化了培養基和培養條件。實驗結果表明，優化培養基為：1.5%乳糖，1.5%蛋白胨，NaCl∶KH2PO4=5∶1，添加量為0.55%；優化培養條件為：接種量為2%，發酵溫度為37℃，培養基初始pH為8.0，種子活化時間為24h，發酵時間為48h，裝液量為50mL，搖床轉速為200r/min時菌株YRD-19-35產酶的酶活力達到最高。在上述條件下，纖維素酶活力可達182.705U/g。

紫外誘變，纖維素酶，酶活力，發酵條件

Abstract：The original strain Bacillus sp.YRD-19 was mutated by U∨，and its enzyme productivity was 5.97 fold higher than that of parent strain.The continuous 6 generations test showed that the mutant YRD-19-35 was stable in the alkaline cellulase（CMCase）production.The effects of compositions of culture medium and cultural conditions on cellulose production were investigated.The optimal culture media were：lactose 1.5%，peptone 1.5%，NaCl∶KH2PO4=5∶1（0.55%）.The optimum enzyme-producing conditions were pH 7.2 at 37℃，and the enzyme activity reached 182.705U/g after 48h of culture.

Key words：ultraviolet mutagenesis；cellulase；enzyme activity；fermentation conditions

堿性纖維素酶在堿性條件下具有內切!-1，4葡聚酶活力，已經成為一種世界各國普遍重視的新型酶制劑，堿性纖維素酶具有耐堿性強、熱穩定性好、pH適應廣泛等特點［2］，已經在洗滌劑工業成功地獲得應用，在食品、化工、造紙、麻紡、環境保護等領域均有重要作用和應用前景［1］。但是長期以來，纖維素酶產生菌的產酶能力都不太理想，因此通過誘變技術選育纖維素酶高產菌株就成了解決這個問題的關鍵［3］。本實驗采用的菌種分離自黃河三角洲鹽堿地區的堿性土壤中，不僅能夠分泌堿性纖維素酶，而且分泌的纖維素酶能夠耐高鹽，可以應用到比較特殊的環境中去。本實驗以枯草芽孢桿菌YRD-19為出發菌株，對其進行紫外誘變，篩選出產酶較高、酶活穩定的菌株YRD-19-35，并且對其產酶條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種YRD-19 由本實驗室從黃河三角洲的鹽堿地區分離到的一株耐鹽堿，并能分泌耐鹽堿纖維素酶的枯草芽孢桿菌；LB液體培養基 蛋白胨10.0g，酵母膏 5.0g，氯化鈉 10.0g，水 1000mL，pH7.0；選擇培養基 羧甲基纖維素鈉10.0g，硫酸銨4.0g，磷酸二氫鉀2.0g，蛋白胨1.0g，七水硫酸鎂0.15g，制霉菌素 50萬單位，瓊脂 16～20g，水 1000mL，pH7.0～7.5；種子活化培養基［2］（30mL/瓶） 蛋白胨10.0g，酵母粉 10.0g，CMC-Na 10.0g，氯化鈉 5.0g，KH2PO41.0g，水 1000mL，pH7.2～7.5；發酵培養基（50mL/瓶）

蛋白胨 10.0g，酵母粉 10.0g，CMC-Na 10.0g，氯化鈉 5.0g，KH2PO41.0g，秸 稈少 許（0.25g/瓶），水1000mL，pH7.2～7.5。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株YRD-19生長曲線的繪制 將菌株YRD-19在LB液體培養基中活化18h，接入250mL三角瓶中，進行搖床培養。并于接種后的第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24h，取一定菌液進行稀釋后，利用分光光度計在600nm的波長下測定吸光度值。然后以OD600為縱坐標，生長時間為橫坐標，繪制出菌株YRD-19的生長曲線。

1.2.2 菌株YRD-19的誘變處理

1.2.2.1 菌懸液的制備 取1環YRD-19菌種接種到液體LB培養基中，培養到對數生長期，然后離心沉淀菌體，棄去上清液［4］。用0.85%生理鹽水（已滅菌）將菌體制成懸浮液，再離心，洗滌菌體兩次。將菌懸液適當稀釋，制備菌懸液，調節菌液濃度約1 ×108個/mL，備用［5］。

1.2.2.2 紫外誘變處理［4］紫外燈照射前，先預熱20～30min。取8個培養皿，然后取5mL菌懸液置于直徑9cm的培養皿中，在磁力攪拌器的攪拌下，選用20W紫外燈，照射距離為30cm，進行不同時間的照射處理。

1.2.2.3 突變株篩選 平板初篩：取誘變后的菌液，適當稀釋后在選擇培養基上進行涂布，以未經誘變的菌液稀釋涂平板對照，37℃培養48h后，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的轉接到LB斜面培養基上［6］。搖瓶復篩：將初篩到的菌株接種到液體發酵培養基上，37℃搖床培養 48h，測定酶活［7］。

1.2.3 產酶條件的優化［8］為了確定誘變菌株YRD-19-35的最優產酶條件，在發酵培養基的基礎上選擇不同的碳源、氮源以及營養鹽之比進行發酵產酶，并通過正交實驗設計和方差分析來確定誘變菌株YRD-19-35的產酶最優培養基配方；并且在產酶最優培養基的基礎上進行發酵條件的優化（種齡、發酵時間、培養溫度、初始pH）。

1.2.4 酶活測定方法［9］發酵液在4℃條件下，經5000r/min離心10min，取上清液作為粗酶液，并且用0.2mol/L的磷酸緩沖液（pH=8.0）進行適當稀釋，取2mL稀釋過的酶液加入到25mL刻度試管中，加入2mL1%的CMC-Na底物溶液，在60℃的水浴中保溫30min，再加入5mL DNS試劑，在沸水中煮沸5min，之后用冷水冷卻至室溫，定容至25mL。在540nm下測定吸光度值，以滅活的酶液作為空白對照。

在pH8.0，60℃條件下，每分鐘水解底物產生1!g還原糖所用的酶量作為一個酶活力單位U/g。

2 結果與分析

2.1 菌株YRD-19生長曲線的測定

由圖1可以看出，YRD-19在一個較短的延遲期后，菌株即進入對數生長期，培養12h以后即進入穩定期，菌體濃度基本保持不變，因此對出發菌株宜選用培養10～11h（對數生長中后期）的菌體制成菌懸液，進行誘變處理。

圖1 菌株YRD-19的生長曲線

2.2 紫外線誘變劑量的選擇

從圖2可以看出，隨著紫外線照射時間的延長，在0～90s照射時間內，菌落數下降較快，活菌數迅速減少。照射時間約為46、62s時，其致死率分別為80%、90%；100s 后，細菌幾乎全部死亡。Leslie A［10］等 和Gerard A［11］等研究表明，致死率為99.0%時，可保證菌體發生最大程度的突變，故在本實驗中選擇在20W紫外燈，菌懸液距紫外燈管30cm下，照射64s為紫外誘變的劑量。

圖2 菌株YRD-19紫外線照射時間與細菌存活率的關系

2.3 菌株的誘變與篩選

2.3.1 致死率為90%的誘變菌株的初篩 通過紫外誘變，一共選出了6株誘變菌株。通過平板初篩，比較各菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值，并與出發菌株進行比較，結果見表1。

由表1可見，6株誘變菌株的水解圈直徑與菌落直徑比值相差比較大，并且比出發菌株YRD-19的要大很多，說明它們的酶活力比出發菌株YRD-19要高，它們之間的酶活也有較大的差異。但是透明圈只能用來初步判定菌株的酶活高低，不能完全代表菌種的產酶能力，這還需要對菌種進行液體發酵復篩。

表1 致死率為90%的初篩菌株與出發菌株的比較

2.3.2 致死率為90%的誘變菌株的復篩 通過搖瓶復篩，測得6株誘變菌株的酶活力，并與出發菌株YRD-19進行比較，結果見表2。

表2 致死率為90%的復篩菌株與出發菌株的酶活比較

從表2可以看出，誘變菌株與出發菌株相比酶活都有了很大的提高。其中，YRD-19-8、YRD-19-13和YRD-19-35的酶活力分別是出發菌株YRD-19 的5.52、5.54、5.97 倍，YRD-19-11、YRD-19-12和YRD-19-32的酶活力分別是出發菌株YRD-19的3.51、3.13、3.23 倍。

2.3.3 誘變菌株酶活穩定性的測定 對6株誘變菌株分別進行了5次傳代，并分別進行了酶活測定，測定結果見表3。

由表3可以看出，經過5次傳代之后，菌株YRD-19-8、YRD-19-11、YRD-19-12 和 YRD-19-13的酶活力都下降了，沒有良好的穩定性；菌株YRD-19-32和YRD-19-35的酶活力基本上保持不變，具有良好的穩定性。菌株YRD-19-35的酶活要比YRD-19-32的高一倍，所以我們最終選用菌株YRD-19-35作為誘變菌株。

表3 6株誘變菌株的酶活穩定性測定結果

2.4 菌株YRD-19-35產酶條件優化

2.4.1 發酵培養基的優化

2.4.1.1 碳源對產酶的影響 碳源是微生物生長和誘導產酶的重要物質。纖維素酶是一種誘導酶，因此選擇合適的碳源是誘導產酶的重要條件。本實驗采用的基礎培養基（%）為：蛋白胨1.0，酵母粉1.0，KH2PO40.1，NaCl 0.5，調節 pH 至7.2，以1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、1%麩皮、1%可溶性淀粉、1%葡萄糖、1%蔗糖和1%乳糖為碳源，進行液體發酵產酶實驗，研究不同碳源對產酶的影響，結果見表4。

表4 不同碳源對產酶的影響

由表4可以看出，添加不同的碳源對纖維素酶活力的影響很大。以乳糖為碳源時產酶最高，說明乳糖是其發酵的最佳碳源。

2.4.1.2 氮源對產酶的影響 本實驗采用的基礎培養基（%）為：乳糖 1.0，KH2PO40.1，NaCl0.5，以 1%蛋白胨、1%酵母粉、1%牛肉膏、0.5%蛋白胨+0.5%酵母粉、1%蛋白胨+1%酵母粉、1%硫酸銨、1%磷酸氫二銨等作為不同氮源，調節pH為7.2，進行液體發酵產酶實驗，研究氮源對產酶的影響，結果如表5所示。

表5 不同氮源對產酶的影響

由表5可以看出，硫酸銨會使發酵液的pH改變過大，影響纖維素酶的產生；磷酸氫二銨對pH的變化有緩沖作用，促進產酶效果較好；而當以蛋白胨作為氮源時產酶最多，所以以1%蛋白胨作為菌株YRD-19-35發酵產酶的最佳氮源。

2.4.1.3 營養鹽對產酶的影響 在產酶發酵培養基中主要有兩種營養鹽：氯化鈉和磷酸二氫鉀，這兩者的添加質量之比對菌株的產酶效果也有一定的影響，本實驗主要研究了以下三個比值對菌株YRD-19-35產酶效果的影響。結果見表6。

表6 不同營養鹽質量分數對產酶的影響

由表6可以看出，當氯化鈉和磷酸二氫鉀的比值為5∶1時，菌株YRD-19-35的產酶效果最佳。

2.4.1.4 正交實驗設計 通過單因素實驗，確定發酵培養基的碳源、氮源以及營養鹽的比例3個因素，即乳糖、蛋白胨、NaCl∶KH2PO4=5∶1。各取 3 個水平，測定發酵產物的纖維素酶活性，進行L9（34）正交實驗，運用SAS程序進行正交實驗設計及正交數據分析，實驗因素與水平見表7。

表7 正交實驗水平表

由表8的 R值分析可知，蛋白胨 ＞乳糖 ＞NaCl∶KH2PO4，對產纖維素酶活影響最大的因素是蛋白胨添加量，其次是乳糖的添加量，而NaCl∶KH2PO4的添加量影響最小。

表8 纖維素酶活正交實驗結果

由方差分析表9可以看出，乳糖和蛋白胨的添加量對纖維素酶活高低影響都顯著，NaCl∶KH2PO4的添加量對纖維素酶活高低影響不顯著。

表9 正交設計纖維素酶活方差分析表

由表10可知，乳糖水平1，3之間差異不顯著，與水平2差異顯著，選擇水平2；蛋白胨水平1，3之間差異不顯著，與水平2差異顯著，選擇水平2；NaCl∶KH2PO4水平2，3之間差異不顯著，與水平1差異顯著，選擇水平1。即纖維素酶活最好的實驗組合為A2B2C1，最佳發酵培養基條件是：乳糖1.5%，蛋白胨1.5%，NaCl∶KH2PO40.55% 。

2.4.2 最適培養基下培養條件的優化

2.4.2.1 種子培養時間對產酶的影響 在最佳發酵培養基的基礎上，將菌齡分別為24、36、48h的種子液接入搖瓶進行發酵實驗，結果如表11所示。

表10 多重比較結果

表11 種子活化時間對產酶的影響

由表11表明，當種子活化24h時再進行發酵，纖維素酶的酶活力最高。

2.4.2.2 發酵時間對產酶的影響 在最佳發酵培養基的基礎上，選定不同發酵時間16、24、36、48、60h 進行酶活測定，結果見圖3。

圖3 發酵時間對產酶的影響

由圖3的結果表明，當發酵時間為48h時，菌株YRD-19-35產纖維素酶的效果最佳。

2.4.2.3 培養溫度對產酶的影響 將培養24h的種子活化液以2%的接種量分別接入發酵培養基中，在不同溫度（25、30、35、37、40、45℃）下進行搖床發酵培養，研究培養溫度對菌株YRD-19-35產酶的影響，結果見圖4。

圖4 溫度對產酶的影響

由圖4的結果表明，當發酵培養溫度為37℃時，菌株YRD-19-35產纖維素酶的效果最佳。

2.4.2.4 培養基的初始pH對發酵產酶的影響 將菌株 YRD-19-35 在不同初始 pH（6.0、7.2、8.0、9.0、10.0、12.0）的發酵產酶培養基條件下進行發酵，研究菌株的產酶情況，結果見圖5。

由圖5可以看出，當培養基的初始pH為8.0時，

菌株YRD-19-35所產纖維素酶的酶活力最高。

圖5 pH對產酶的影響

3 結論

枯草芽孢桿菌YRD-19經過紫外誘變，選育到一株纖維素酶活力提高5.97倍的誘變菌株YRD-19-35，在最優發酵產酶條件下，纖維素酶活力最高可達到182.705U/g，比出發菌株27.213 U/g提高了6.71倍。

實驗結果表明：菌株YRD-19-35適合產酶的最優培養基條件為：1.5%乳糖，1.5%蛋白胨，NaCl∶KH2PO4=5∶1，添加量為 0.55% 。在此最適培養基基礎上，研究溫度、pH、種子活化時間及發酵時間等因素對產酶的影響。實驗結果表明：發酵溫度為37℃，pH為8.0，種子活化時間為24h，發酵時間為48h，時菌株YRD-19-35產酶的酶活力達到最高。

通過產酶條件優化實驗的研究發現，誘變菌株YRD-19-35誘導產酶的最佳碳源是乳糖。而之前發表過的文章多采用的是蔗糖［2］，羧甲基纖維素鈉［13］以及麩皮［8，12］等等，用乳糖作為纖維素酶的誘導劑還沒有研究。并且與以上這三種碳源相比較，使用乳糖作為該菌株的誘導劑，酶活分別提高了7.52%、33.30%和13.75%。

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Study on the screening and fermentation of osmophilic of alkaline cellulase higher production strain Baci//us sp.YRD-19

GUI Chun-yan1，CHEN Yi-lun1，*，XIE Xiao-ping2，DONG Xin-rui2，SONG Ji2，WU Yu-shuang3，HAN Ming-qu3，DIAO Ri-ming4，ZHOU Bo2，*
（1.Institute of Food Science and Engineering，Shandong Agriculture University，Tai’an 271018，China；2.Institute of Life Sciences，Shandong Agriculture University，Tai’an 271018，China；3.Beijing Huitongda Technology Company，Beijing 100086，China；4.Tianjin Muguang Bio-Technology Company，Tianjin 300193，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0163-05

2009-09-25 *通訊聯系人

桂春燕（1984-），女，在讀碩士研究生，研究方向：應用微生物。

國家科技基礎條件平臺微生物菌種資源整理整合項目（2005DKA21201-13）；國家科技支撐計劃黃淮平原區農田秸稈資源綜合利用技術集成研究與示范（2007BAD89B09-16）資助。