蠶豆根尖微核實驗陽性結果判斷標準研究

李 紅，丁曉雯，*，石 晶，王海燕

（1.西南大學食品科學學院，重慶400716；2.重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶400716）

蠶豆根尖微核實驗陽性結果判斷標準研究

李 紅1，2，丁曉雯1，2，*，石 晶1，2，王海燕1，2

（1.西南大學食品科學學院，重慶400716；2.重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶400716）

目的：研究蠶豆根尖微核實驗陽性結果判斷標準。方法：蠶豆根尖微核實驗。結果：用方差分析（t檢驗）比較各致突變物微核率與對照組微核率的差異顯著性，提出當微核指數大于1.5時，可以判定實驗結果為陽性，即該物質確有致突變性。

蠶豆根尖微核，致突變，微核指數

Abstract：Aim：To study the judgment criterion of positive result in Vicia faba root tips micronucleus test.Methods：Micronucleus test of Vicia faba root tip cells.Conclusions：The analysis of variance（t test）was used to compare the significance of difference between the micro-nucleus rate that measured by these mutagens and the control group，proposing if the micro-nuclear index more than 1.5，then it can be judged the result was the positive result，that is to say，the material did lead to mutation.

Key words：micronucleus of Vicia faba root tips；mutagenicity；micro-nuclear index

蠶豆根尖微核實驗是全球公認的環境致突變性檢測技術［1］，也是我國環境生物測試的規范方法［2］，目前該實驗技術也用于食品遺傳作用的評價［3-5］。蠶豆根尖微核實驗作為環境致突變性檢測技術有其他檢測手段無法比擬的很多優點，水質遺傳毒性檢測中污染指數的引入，很好地避免了因實驗條件等因素帶來的本底微核率的波動，把微核率與污染程度聯系起來，可以直觀地根據污染指數（Pollution index，PI）鑒定所測水樣的污染程度［6］，準確而快速。但是污染指數只適用于水質污染程度的判斷?，F在利用蠶豆根尖微核實驗檢測食品致突變物仍是根據樣本組和陰性對照組的微核千分率差異是否具有顯著性來判斷，不方便而且準確性不夠好。所以需要探索建立一個比較合適的、定量的陽性結果判斷標準。在食品致突變物的檢測中能否像水環境中污染指數一樣也引入一個指數，通過這個指數不僅可以避免因實驗條件等因素而產生的誤差，而且能準確而快速地判定實驗結果。微核指數就是在這種思路下提出并探索用于食品中致突變物的判定。環磷酰胺是公認的蠶豆根尖微核實驗的標準陽性樣本［3，7］，重鉻酸鉀、疊氮鈉、硝酸鉛也都有致突變性［8-9］，能誘發蠶豆根尖產生微核，所以本實驗用環磷酰胺、重鉻酸鉀、疊氮鈉、硝酸鉛四個陽性樣本進行蠶豆根尖實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶豆 購于北碚農貿市場；環磷酰胺 山西普德藥業有限公司；疊氮鈉（化學純） 浙江城關化工廠；重鉻酸鉀 分析純，重慶北碚化學試劑廠；硝酸鉛 分析純，重慶吉元化學有限公司；堿性品紅 分析純，中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；卡諾氏固定液 無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，自制；本實驗所用其它試劑 均為分析純；水 均為蒸餾水。

顯微鏡 XSN-3G顯微鏡，重慶光電儀器有限公司。

1.2 實驗方法

蠶豆根尖微核實驗方法參照文獻［10］。用致突變物環磷酰胺、疊氮鈉（NaN3）、重鉻酸鉀（K2Cr2O7）、硝酸鉛（Pb（NO3）2）分別配成不同的濃度梯度，對發芽種子7粒蠶豆根尖進行侵染處理。每個濃度的實驗樣本吸取20mL于培養皿中，再將發芽蠶豆的根尖放入，使樣本液浸泡住根尖5h。然后恢復培養、固定和染色。每組取5條根尖制片，在40倍鏡下分別觀察1000個細胞，計數微核細胞數。每次實驗以蒸餾水作陰性對照，求出微核率和微核指數，計算公式如下：

表1 各種陽性致突變物誘導蠶豆根尖微核率與微核指數

2 結果與討論

2.1 微核的識別

微核形態為圓形、橢圓形和不規則形的，并與主核分離的小核。微核在嗜色性、折光性、內部結構、邊緣光整、所處平面、厚度等方面與主核一致，其直徑為主核直徑的1/20～1/3。詳見圖1～圖4，箭頭所指為微核。

圖1 蠶豆根尖微核40倍顯微鏡下攝片（a）

2.2 不同樣本對蠶豆根尖微核率的影響

各種陽性致突變物的微核實驗結果見表1。從表1可以看出，用蒸餾水作陰性對照的微核率為8.74‰，符合生物監測規范上提出的本底微核率不超過 10‰ 的要求［2］。

圖2 蠶豆根尖微核40倍顯微鏡下攝片（b）

圖3 蠶豆根尖微核100倍油鏡下攝片（a）

圖4 蠶豆根尖微核100倍油鏡下攝片（b）

從表1可以看出，環磷酰胺的致突變性，0.1、1、10、20、50!g/mL的環磷酰胺的微核率均明顯高于陰性對照的微核率。經t檢驗，其P值均小于0.01，能誘發蠶豆根尖細胞微核率的顯著提高。表1表明，環磷酰胺在0.1～10!g/mL的范圍內與蠶豆根尖微核有明顯的劑量效應關系，但20!g/mL以后微核率降低。研究表明，蠶豆根尖細胞也存在應激性，常溫下在接觸低劑量的誘變因子后，會對更高劑量的誘變因子產生適應性，從而減弱誘變劑對細胞的損傷［11］。所以，環磷酰胺濃度過大可能使蠶豆根尖產生了適應性，反而會抑制微核的產生。但可以肯定，環磷酰胺在一定濃度范圍內對蠶豆根尖細胞有致突變的誘導效應。

實驗確定0.1～50!g/mL的濃度范圍內的重鉻酸鉀、疊氮鈉和0.1～100!g/mL濃度范圍內硝酸鉛都在蠶豆根尖微核實驗中都有一定的致突變性，所以通過本實驗進一步驗證了其陽性致突變性。

實驗結果中當重鉻酸鉀濃度為0.1!g/mL時微核指數為1.37，差異不顯著，硝酸鉛濃度為0.1!g/mL時微核指數為1.38，差異顯著，可以初步提出微核指數大于1.38時，該化學物質就有致突變性，結果為陽性。但是，綜合比較其他實驗計算出的微核指數［3-5，8，12］，我們可以謹慎地提出蠶豆根尖微核實驗當微核指數大于1.5時，實驗結果即為陽性。本研究中也驗證了此結果，微核指數在此之上，差異均為極顯著，微核實驗結果均為陽性。

3 結論

根據以上實驗研究結果，提出用蠶豆根尖微核實驗測定食品或其他環境中化學物質的致突變性，當微核指數大于1.5時，可以判定實驗結果為陽性，即該物質確有致突變性。

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Study on judgment criterion of positive result in Vicia Faba root tips micronucleus test

LI Hong1，2，DING Xiao-wen1，2，*，SHI Jing1，2，WANG Hai-yan1，2
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Laboratory of Agricultural Product Processing Technique in Chongqing，Chongqing 400716，China）

TS201.1

A

1002-0306（2010）10-0229-03

2009-09-03 *通訊聯系人

李紅（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品質量與安全。