誘導型一氧化氮合酶在衰老大鼠心肌對缺血再灌注損傷敏感性增加中的作用1)

田 玨,燕 子,王 瑾,馬秀瑞,呂婷婷,劉慧榮

大量的動物實驗和臨床研究表明,衰老心臟對缺血再灌注損傷較成年更為敏感[1,2],衰老的心臟梗死面積大、病人的療效和預后差[3-5]。全球60歲以上衰老人口比例將從2000年的10.0%增至2050年的21.8%、2100年的32.2%[6]。這促使我們要努力揭示衰老對心肌缺血再灌注損傷的敏感性增加的機制,進而尋求更有效的防治措施。有研究表明衰老大鼠心肌缺血再灌注時過氧亞硝基陰離子(ONOO-)含量增加[7],但ONOO-的增加與心肌缺血再灌注損傷敏感性增加的關系有待進一步證實,ONOO-增加的原因也有待進一步研究。一氧化氮(NO)及其衍生物活性氮簇(RNS)具有促凋亡和抗凋亡的雙重作用,普遍認為低濃度/低活性的RNS,如:eNOS催化生成的NO具有細胞保護作用;高濃度/高活性的RNS,如:iNOS催化生成的NO及其與超氧化物的雙自由基反應產物ONOO-具有細胞毒性[8-11],衰老大鼠心肌缺血再灌注時ONOO-含量增加是否與iNOS有關,目前仍不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠,成年大鼠(4～6月齡),衰老大鼠(22～24月齡),購自四川省醫學科學院實驗動物研究所。隨機分為 3組,成年缺血再灌注組(缺血30 min,再灌注24 h)、衰老缺血再灌注組(缺血30 min,再灌注24 h),衰老缺血再灌注+1 400W 組(缺血 30 min,再灌注 24 h,缺血前 24 h及再灌注前25 min分別腹腔注射iNOS特異性阻斷劑1 400 W,2 mg/kg)。每組6只。

1.2 在體大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 10%水合氯醛麻醉動物。行氣管插管,機械通氣,頻率60/min,潮氣量 8 mL,吸呼比1:2。連接心電電極檢測Ⅱ導心電圖。沿胸骨左緣心臟搏動處縱行切開皮膚約2 cm,將6-0無創縫合針于左心耳根部下方2 mm處穿過心肌表層,在肺動脈圓錐旁出針。觀察心電圖,待其恢復穩定15 min后打一活結以結扎左冠脈前降支(LAD),心肌缺血成功的標志為:心電圖Ⅱ導聯ST段弓背向上抬高0.4 mV以上。30 min后松結扎線,心電圖Ⅱ導聯ST段下降1/2以上作為心肌組織恢復血液灌流的標志。缺血30 min,再灌注 24 h。

1.3 心肌梗死面積測定 心肌缺血30 min再灌注24 h后,再次結扎 LAD,經股靜脈注入2%Evans blue,30 s～60 s內摘取心臟,用掃描儀對心臟切面進行掃描,利用Image-ProPlus5.0圖像分析系統分析,分別測定藍色、紅色、白色區域面積,左心室面積(left ventricle,LV)為藍色、紅色和白色面積之和;危險區總面積(area at risk,AAR)為紅色和白色面積之和;梗死區面積(area of necrosis,AN)為白色面積。結果以危險區面積與左心室面積的比值來判斷手術手法有無差異性,以梗死區面積與危險區總面積的比值來表示心肌梗死面積大小。

1.4 心肌組織硝基酪氨酸含量檢測 應用雙抗體夾心ELISA法檢測BCA法檢測蛋白濃度。使用酶標儀在波長490 nm處測定光密度(OD)值。用含有已知劑量硝基酪氨酸的、硝酸化的BSA制作標準曲線,通過標準曲線計算組織樣本中硝基酪氨酸含量,結果用每克蛋白含硝基酪氨酸量表示。

1.5 Western-blot測定iNOS蛋白表達 利用SDS-PAGE電泳技術分離組織勻漿中的蛋白,再轉移至硝酸纖維素膜,用iNOS單克隆抗體(BD Transduction Laboratories)進行免疫印跡檢測心肌組織iNOS含量。以大鼠心肌組織GAPDH的蛋白表達量作為內參。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析。實驗結果以均數±標準差(±s)表示,多個樣本均數比較采用單因素方差分析,兩樣本均數組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 年齡因素對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響心肌缺血再灌注后,衰老大鼠心梗面積較成年大鼠明顯增大(P＜0.05)。YI/R為成年缺血再灌注組;OI/R為衰老缺血再灌注組;OI/R+1400W為衰老缺血再灌注+1400W組。詳見圖1。

圖1 各組心肌梗死面積比較

2.2 衰老組大鼠心肌ONOO-含量 衰老缺血再灌注組心肌組織NT含量較成年缺血再灌注組明顯增高(7.29±0.1vs 3.2±0.1,P＜0.05)。詳見圖 2。

2.3 衰老組大鼠心肌組織iNOS表達增高 與正常成年大鼠比較,正常衰老大鼠iNOS表達升高(P＜0.05);與成年缺血/再灌注組比較,衰老缺血/再灌注組iNOS表達升高(P＜0.05)。詳見圖3。

圖3 各組心肌組織iNOS的表達

2.4 衰老大鼠心肌組織中NT含量 用iNOS的特異性阻斷劑1 400 W阻斷iNOS后發現,缺血再灌注后,衰老大鼠心肌組織的 NT明顯下降(P＜0.05)。詳見圖2。

2.5 衰老大鼠梗死面積 衰老心肌缺血再灌注+1400W組大鼠心梗面積較衰老心肌缺血再灌注組明顯減小(P＜0.05)。詳見圖1。

3 討 論

缺血再灌注損傷直接影響著缺血性疾病的治療效果和預后,衰老的心臟對缺血再灌注損傷的敏感性增加,衰老患者溶栓率低、心衰、休克、心律失常等并發癥較為常見,病死率高[12]。

凋亡在心肌再灌注損傷中發揮重要作用,降低心肌細胞凋亡可以顯著減少心梗面積,改善心功能。已有研究顯示衰老時心肌細胞凋亡增加,如能揭示衰老時心肌細胞凋亡增加的潛在機制,有利于解釋衰老時心臟對缺血再灌注損傷易感性增加的原因,還可能為特異性扭轉機體這一系列損傷提供新的思路。

前期的研究結果表明,心肌缺血再灌注時,衰老大鼠心肌細胞凋亡指數和Caspase-3的活性明顯高于成年大鼠,提示衰老大鼠對心肌缺血再灌注損傷的敏感性增加;同時發現衰老大鼠缺血再灌注心肌組織ONOO-含量增加。但ONOO-增加與衰老大鼠對心肌缺血再灌注損傷的敏感性增加的關系有待進一步明確,ONOO-的來源也有待研究。本實驗觀察到,衰老大鼠缺血再灌注時心梗面積較成年大鼠增大,衰老心肌組織缺血再灌注時ONOO-的水平增高,同時衰老大鼠iNOS表達升高,當給予iNOS特異性阻斷劑1 400 W后,衰老大鼠缺血再灌注心肌組織ONOO-下降,同時心梗面積減小。因此衰老大鼠對心肌缺血再灌注損傷敏感性增加可能是由于衰老心臟中iNOS表達升高,催化生成大量NO進而生成毒性的ONOO-,從而損傷引起心肌損傷。

本研究結果提示,在臨床治療中或許可以通過降低iNOS表達、抑制iNOS活性或使用ONOO-解毒劑來部分減輕老年患者對心肌缺血再灌注損傷的敏感性,從而提高老年冠心病患者的療效,降低病死率,改善老年冠心病患者的生命質量。但為何衰老的心肌iNOS表達會增高?升高的NO及其毒性衍生物ONOO-又是通過何種機制使得衰老心肌凋亡增加、對缺血再灌注損傷更加敏感?這些均有待于進一步研究,以更好地揭示衰老心臟對缺血再灌注損傷易感性增加的機制。

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