比索洛爾與阿托伐他汀對高血壓大鼠心肌纖維化影響的實驗研究

李元珍,李 征,李茹香

心肌纖維化是多種心血管疾病(如高血壓、心肌梗死、心力衰竭、心律失常、猝死等)發展到一定階段的共同病理改變,因此,防止和逆轉心肌纖維化已成為治療心血管疾病的主要目的。β受體阻滯劑與他汀類藥物已廣泛應用于臨床。本研究以腎性高血壓大鼠為模型,觀察在使用高選擇性β1受體阻滯劑比索洛爾的基礎上加用阿托伐他汀對高血壓心肌纖維化的影響,并探討其逆轉心肌纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 雄性Wistar大鼠24只(購于山西醫科大學生理教研室,體重180 g～230 g),將其隨機分為3組,比索洛爾組、阿托伐他汀組、比索洛爾+阿托伐他汀組。用10%的水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉,開腹,用內徑0.25 mm的銀夾鉗夾3組大鼠左側腎動脈使其部分狹窄,術后4周測尾動脈收縮壓,高于20 kpa者為高血壓模型制備成功。比索洛爾組用蒸餾水(1 mL)溶解的比索洛爾[(2 mg/(kg?d)],阿托伐他汀組用蒸餾水(1 mL)溶解的阿托伐他汀灌胃[50 mg/(kg?d)],聯合用藥組同時使用上述兩種藥物,連續觀察8周。

1.2 標本采集與處理 術后12周末,用20%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉大鼠,開胸取出心臟,以冰生理鹽水沖洗干凈,吸干水分,去除大血管、左右心房、右心室,取左心室并稱其重量即左心室重量(LVM)除以體重(BW)得到左室重量指數(LVMI)。將左室心肌標本橫切分為兩份,中下段部分凍存與-70℃冰箱中,另取左室中上斷橫切面組織一塊,經10%甲醛固定 24 h,常規脫水,石蠟包埋,制成 4 μ m切片,分別行心肌 VG染色,及MMP-9的免疫組化染色。

1.3 心肌羥脯氨酸(HC)濃度的測量 羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分,而且動物組織中的羥脯氨酸幾乎完全來自膠原,因此,心肌組織內羥脯氨酸的含量可以代表膠原的水平,即反映心肌纖維化的程度。按試劑說明書,100 mg心肌組織勻漿、消化、水解、取上清,使用分光光度計在550 nm處測各管吸光度。羥脯氨酸濃度=[(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)]×標準管含量(5 μ g/mL)×[水解液總體積(10 mL)/組織濕重(mg)]。

1.4 心肌膠原纖維的半定量分析 組織切片進行苦味酸-酸性品紅(VG)膠原染色,利用圖像分析系統,測量心肌膠原灰度值(反映組織化學染色產物深淺程度,灰度值越大,則反應產物濃度越小,反之,產物濃度越大)。測量心肌膠原容積分數(CVF),CVF=膠原面積/總面積。每張切片隨機取(4～6)個視野取其平均值。

1.5 基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達水平測定 MM P-9采用SP三步法免疫組化染色,一抗為羊多抗IgG(購于北京中衫金橋有限公司),二抗為SPABC試劑盒(購于北京中衫金橋有限公司),按試劑盒說明書操作,利用圖像分析系統進行分析,測量其灰度值,每張切片平均選取(4～6)個視野。

2 結 果

2.1 各組大鼠血壓、LVMI、HC及CVF結果(見表1) 與治療前相比,比索洛爾組及聯合用藥組治療后大鼠血壓明顯降低(P＜0.05),而阿托伐他汀組血壓略有下降,但治療前后相比無統計學意義(P＞0.05)。3組大鼠治療后較治療前LVMI、HC、CVF明顯改善(P＜0.05),且比索洛爾組對于改善 LVMI、HC、CVF優于阿托伐他汀組(P＜0.05),聯合用藥組改善LVMI、HC、CVF優于另外兩組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠心肌LVMI、HC及CVF結果比較(±s)

表1 各組大鼠心肌LVMI、HC及CVF結果比較(±s)

組別 n SBP(mmHg) LVMI(mg/g) HC(μ g/mg) CVF比索洛爾組 治療前 8 175.43±16.53 1.87±0.20 81.3±3.4 2.01±0.52治療后 8 154.67±16.241)2) 1.08±0.231)2) 48.2±1.51)2) 1.29±0.321)2)阿托伐他汀組 治療前 8 178.75±16.87 1.93±0.23 79.4±3.6 1.99±0.50治療后 8 165.50±17.98 1.23±0.211) 50.1±1.31) 1.30±0.331)聯合用藥組 治療前 8 176.31±18.23 1.97±0.22 78.7±3.8 1.98±0.49治療后 8 142.51±17.971)3) 0.98±0.191)3) 40.6±1.11)3) 1.16±0.261)3)與同組治療前相比,1)P＜0.05;與阿托伐他汀治療后比較,2)P＜0.05;與比索洛爾組治療后比較,3)P＜0.05

2.2 心肌膠原組織學測定 各組大鼠心肌VG染色,顯微鏡下攝圖,間質膠原為紫紅色,心肌細胞為黃色,治療后較治療前血管周圍及心肌間質膠原明顯減少。

2.3 各組大鼠心肌MMP-9免疫組化染色及半定量分析 3組大鼠治療后較治療前MMP-9表達明顯降低,灰度值明顯升高(P＜0.05),比索洛爾組對于降低MMP-9表達優于阿托伐他汀組(P＜0.05),聯合用藥組降低MMP-9表達優于另外兩組(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠MM P-9免疫組化染色及半定量分析(±s)

表2 各組大鼠MM P-9免疫組化染色及半定量分析(±s)

組別 n MMP-9灰度值比索洛爾組 治療前 8 150.874±20.176治療后 8 161.351±16.2381)2)阿托伐他汀組 治療前 8 149.640±19.013治療后 8 153.844±12.8811)聯合用藥組 治療前 8 151.429±20.131治療后 8 168.657±17.3511)3)與同組治療前相比,1)P＜0.05;與阿托伐他汀治療后比較,2)P＜0.05;與比索洛爾組治療后比較,3)P＜0.05

3 討 論

高血壓是最常見的心腦血管疾病,高血壓的持續發展可引起心室重構、心肌纖維化。心肌纖維化是指心肌間質膠原濃度顯著升高及膠原特性構型的改變,其形成機制非常復雜,涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)及多種細胞因子,而各種細胞因子在影響心肌膠原合成和降解中的相互關系仍不十分清楚。在本實驗中,建立了腎血管性高血壓大鼠模型,通過測量大鼠LVM I,檢測HC濃度,VG染色檢測CVF,表明比索洛爾、阿托伐他汀、聯合用藥均可改善大鼠心肌纖維化,且比索洛爾組對于改善LVM I、HC、CVF優于阿托伐他汀組(P＜0.05),聯合用藥組改善LVM I、HC、CVF優于另外兩組(P＜0.05)。β受體阻滯劑可以同時阻滯交感神經系統與腎素-血管緊張素-醛固酮系統,可以降低心室率,降低心肌耗氧量,增加冠狀動脈的灌注。比索洛爾是一種高選擇性β1受體阻滯劑,降低血壓作用確切,且有可能降低心肌細胞促炎因子,逆轉心室重構。近年來,隨著幾個大規模臨床試驗的揭曉,證實β受體阻滯劑可以減退心臟功能下降,阻止并逆轉左心室肥厚,改善心臟本身的收縮功能及心力衰竭患者的預后,降低病死率[1,2]。β受體阻滯劑因其獨特的藥理特性已成為臨床及基礎研究中一個令人矚目的熱點。本研究顯示,以比索洛爾為代表的高選擇性β受體阻滯劑治療腎性高血壓大鼠血壓療效確切,且有效逆轉大鼠心肌纖維化,其作用與抑制M MP-9的表達有關。

近年來的一系列大規模實驗如4S、CARE、LIPID等均表明他汀類藥物除調脂外還具有重要的非調脂作用,如穩定粥樣硬化斑塊、防止心室重構、抗血栓等。他汀類的這種多效性作用正日益受到人們的重視,使其成為心血管病治療中的基礎性用藥之一,其作用機制可能與抑制平滑肌細胞增殖、遷移,保護血管內膜,舒張血管,抑制心肌纖維膠原合成等有關,但他汀類藥物是否可以明顯降低血壓及其抗心肌纖維化的具體機制仍不明確。Pasquale等[3]納入887例患者進行薈萃分析結果顯示,他汀類藥物組的收縮壓比對照組平均低1.9 mmHg(P＜0.05)。而本實驗阿托伐他汀組治療后與治療前相比,大鼠收縮壓雖有下降趨勢,卻無統計學意義,可能與本實驗的樣本量較小、治療持續時間短有關。

在眾多的細胞因子之中,MMP-9是心肌纖維化的重要調控因素。MM P-9又稱明膠酶B,是降解Ⅳ型膠原的主要成員之一,不僅在心臟基質成分的降解中起作用,而且還調節膠原蛋白的合成。Sakata等[4]高血壓型 HF大鼠模型,第 23周左室無擴大,但MMP-2和MMP-9的mRNA水平與酶活性水平升高。第26周左室擴大,HF并且出現肺水腫,提示MM P-2和MM P-9升高早于左室擴大,是反映心肌纖維化的早期敏感指標。MM P-9表達的上調,參與許多心血管疾病的發生發展,而MMP-9的抑制劑則可以減弱心室重構,改善心功能。Tziakas等[5]的研究顯示,阿托伐他汀治療可降低ACS患者MMP-9水平。本研究顯示,3組大鼠治療后較治療前M MP-9表達明顯降低,灰度值明顯升高(P＜0.05),比索洛爾組對于降低MM P-9表達優于阿托伐他汀組(P＜0.05),聯合用藥組降低MM P-9表達優于另外兩組(P＜0.05)。

比索洛爾、阿托伐他汀均能有效抑制大鼠心肌纖維化的形成,其機制與降低MM P-9表達水平有關,且比索洛爾療效優于阿托伐他汀,聯合用藥組療效更加明顯,二者之間存在協同作用。

[1]Simon T,Mary-Krause M,Funck-Brentano C,et al.Bisoprohol dose-response relationship in patients,with congestive heart failure,a subgroup analysis in the cardiac insufficiency bisoprolol study(CIBISIⅡ)[J].Eur Heart J,2003,24(6):552-559.

[2]Gullestad L,Manhenke C,Aarsland T,et al.Effect of metoprolol CR/XL on exercise tolerance in chronic heart failure:A substudy to the MERIT-HF trial[J].Eur J Heart fail,2001,3(4):463-468.

[3]Pasquale S,Sally MK.Do statins reduce blood pressure A meta-analysis of randomized,controlled trials[J].Hypertensions,2007,49(4):792-798.

[4]Sakata Y,Yamamoto Y,Mano T,et al.Activation of matrix metalloproteinases precedes left ventricular remodeling in hypertensive heart failure rats:Its inhibition as a primary effect of angiotensinconverting enzyme inhibitor[J].Circulation,2004,109(17):2143-2149.

[5]Tziakas DN,Chalikias GK,Parissis JT,et al.Serum profiles of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitor in patients with acute coronary sy ndromes.T he effects of short-term atorvastatin administration[J].Int J Cardiol,2004,94(2-3):269-277.