實驗性腦出血大鼠急性期腦組織含水量與ET、NO含量的關系

劉文立,張生林

腦出血是急性腦血管疾病的危重類型,其發生率、致殘率和病死率均較高。腦出血后腦水腫形成是腦出血的重要并發癥,也是臨床腦出血病人病情加重和死亡的主要原因之一,但腦出血后腦水腫形成的病理機制至今尚未完全闡明。內皮素(endothelin,ET)和一氧化氮(nitric oxide,NO)是近年來發現的血管活性物質,兩者在腦血流調節中起重要作用[1]。本實驗旨在通過建立大鼠腦出血模型,觀察腦出血后血腫周圍腦組織含水量與ET、NO含量之間的關系,探討ET、NO在腦出血后腦水腫形成中的作用,為臨床治療提供新的理論依據和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用健康雄性SD大鼠48只,體重250 g～300 g,由山西醫科大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為腦出血組和假手術對照組,每組24只,兩組動物再隨機分為術后1 d,3 d,5,7 d 4個時間點,每個時間點6只,分別用于測定腦組織含水量與ET、NO含量。

1.2 動物模型制備 采用Rosenberg等報道的方法,將大鼠用20%烏拉坦(0.35 mg/100 g)腹腔注射麻醉,固定于立體定向儀(江灣I型)上。頭皮下正中切口約1.0 cm,于顱骨背側前囟后1.0 mm,右側旁開3.0 mm處鉆孔,用微量注射器沿鉆孔垂直進針約5.8 mm。腦出血組在右側尾狀核注射溶有Ⅶ型膠原酶(0.5 U/2 μ L)的生理鹽水2μL,2 min內注射完畢,留針5 min。Ⅶ型膠原酶由美國Sigma公司提供。對照組在右側尾狀核注入2 μ L生理鹽水,然后縫合頭皮。術后觀察神經系統癥狀,大鼠出現病灶對側偏癱、行走時有不同程度的旋轉、患側前肢內收及后肢外展,視為模型成功[2]。

1.3 腦組織樣本的采取 按各組預定時間過量麻醉處死大鼠,開顱取腦。腦出血組將腦血腫所在的右側大腦沿血腫正中冠狀切面切開,取血腫前部腦組織200 mg做腦含水量測定,取血腫后內腦組織約200 mg測定NO含量,取血腫后外腦組織約100 mg測定ET含量。對照組取右側大腦按上述方法進行操作。

1.4 腦組織含水量的測定 用干濕重法測定腦組織含水量。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%[3]。

1.5 腦組織ET含量的測定 采用放射免疫分析法測定ET,試劑盒購自解放軍總醫院科技開發中心放免研究所。

1.6 腦組織NO含量的測定 采用硝酸還原酶法測定NO,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 結 果

2.1 腦組織ET、NO含量及腦含水量變化 腦出血組各時間點腦組織ET、NO含量及腦含水量均高于假手術對照組(P＜0.05或 P＜0.01)。腦出血組腦組織ET、NO含量及腦含水量均于1 d升高,3 d達高峰,5 d下降(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織ET、NO含量及腦含水量(±s)

表1 各組大鼠腦組織ET、NO含量及腦含水量(±s)

組別 動物數只ET pg/mL NO μ mol/mgpr含水量%腦出血組 1 d 6 99.42±3.452) 4.40±1.462)80.23±1.212)3 d 6 106.23±4.792) 6.64±1.392)82.00±1.452)5 d 6 94.43±1.942) 2.87±1.181)78.53±0.812)7 d 6 93.50±2.111) 2.70±0.791)77.86±1.071)假手術組 1 d 6 92.58±2.61 2.26±0.65 77.01±1.02 3 d 6 91.82±2.03 2.03±0.35 76.41±1.02 5 d 6 91.23±1.39 1.56±0.76 75.83±1.50 7 d 6 90.71±1.39 1.54±0.66 75.61±1.69與假手術組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 腦組織含水量與ET、NO含量的關系 經相關分析,結果顯示腦出血大鼠急性期腦組織含水量與ET、NO含量均呈正相關關系(P＜0.05或P＜0.01)。詳見表 2。

表2 腦出血大鼠急性期腦組織含水量與ET、NO含量相關分析

3 討 論

3.1 腦出血后腦水腫與ET的關系 ET是一種由21個氨基酸組成的血管活性多肽,是目前所知作用最強的長效血管收縮劑[4]。ET不僅存在于神經系統的一些內皮細胞中,也廣泛分布于神經細胞內[5]。已證實神經膠質細胞也產生ET,并以旁分泌的方式對神經膠質細胞和神經元發揮作用,證明ET可能為一種潛在的神經調節因子,并具有強大的縮血管作用[6]。劉愛芬等[7]測定觀察了57例腦出血患者血漿ET含量的變化,結果發現腦出血后24 h內血漿ET水平即開始升高,1 d～3 d達高峰,之后維持在較高水平直至14 d,半月后開始下降,1月后基本降至正常水平。這與腦出血后腦水腫的形成時程一致。張微微等[8]報道大鼠腦出血后腦內ET-1的表達與腦水含量的變化規律基本一致。陳紅霞等[9]報道急性腦出血患者在出血后第1天、第4天的血漿內皮素含量明顯高于對照組。

本研究結果顯示大鼠腦出血后,血腫周圍腦組織含水量與ET含量均于1 d時升高,3 d時達高峰,5 d降低,7 d與5 d差別不顯著,腦組織含水量與ET含量呈正相關關系。表明ET參與了腦出血后腦水腫的發生、發展。腦出血后ET升高可能與下列因素有關:應激狀態下兒茶酚胺大量生成誘導ET過量合成。腦出血時,紅細胞破壞釋放氧合血紅蛋白(HbO2),刺激血管內皮細胞產生ET,還可能通過抑制cGMP或cAMP促進ET釋放增多[10]。局部因素如腎上腺素、凝血酶增多等加速ET合成。腦出血時,顱內壓增高,灌注壓降低,缺血缺氧使ET合成、釋放增多[11]。腦出血后內皮素過量合成,通過ET受體誘導細胞內Ca2+超載,血管收縮,細胞水腫;此外,內皮素分泌增多,調控Na+-H+交換,促進Na+內流,使細胞內 Na+濃度增高[12];內皮素還激活磷脂酶A2產生花生四烯酸,后者及其代謝產物可引起毛細血管通透性升高。因此,ET促進了腦出血后腦水腫的發生及發展。

3.2 腦出血后腦水腫與NO的關系 NO在體內扮演著生理和病理的雙重角色,它產生異常與臨床多種疾病的發生發展有密切關系。腦內NO既可起腦保護作用,又可起神經細胞毒性作用[13]。NO是由 L-精氨酸在NO合酶(NOS)催化下生成的。生理量的NO可擴張血管,改善微循環及抗血小板凝聚等,但NO產生過多則會損害神經原,產生病理效應。王永志等[14]通過臨床研究報道,腦出血急性期血清NO水平較恢復期明顯升高,穩定期血清NO水平仍高于對照組,恢復期接近正常水平。這與腦出血后腦水腫的變化規律基本一致。Chen等[15]報道,通過檢測351例腦出血患者急性期血漿NO值及100例健康成人血漿NO值,結果發現,腦出血患者急性期血漿NO均值較健康成人血漿NO均值顯著升高。楊文清等[16]報道,大鼠腦出血后4 h腦組織中NO含量增加,72 h達到高峰。

本研究發現,大鼠腦出血后血腫周圍腦組織含水量與NO含量均于1 d時升高,3 d時達高峰,5 d降低,7 d與5 d差別不顯著,腦組織含水量與NO含量呈正相關關系。說明NO參與了腦出血后腦水腫的發生、發展。腦出血后NO升高的原因可能是,腦出血時腦細胞釋放大量谷氨酸;激活了N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體,促進Ca2+大量內流并與CaM結合,從而激活了 Ca2+依賴性cNOS,產生大量的 NO[17];同時,出血灶周圍大量白細胞浸潤和聚集,激活了iNOS,從而導致NO的大量產生。高濃度的NO可與周圍的超氧陰離子(O2-)迅速反應,生成另一具有強氧化作用的自由基-過氧亞硝基陰離子(ONOO-)而產生細胞毒性作用[18-20]。ONOO-可有效地氧化蛋白質疏基、Fe/s中心、鋅指結構、硝基化蛋白質的酪氨酸殘基,使許多重要的蛋白質或酶失活,影響細胞代謝,并抑制呼吸鏈酶,破壞線粒體結構,使DNA斷裂,并可啟動脂質過氧化[21],導致大腦微血管內皮細胞壞死,通透性增強,腦水腫形成。

腦出血后腦組織內ET和NO含量均升高,且與腦水腫程度呈正相關關系。ET和NO參與了腦出血后腦水腫的發生及發展。這為今后腦出血患者的治療提供了一定的理論根據。可否應用ET受體拮抗劑和適量應用NOS抑制劑治療急性腦出血,有待于進一步研究。

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