參蛇偏癱膠囊聯(lián)合尼莫地平預處理對腦缺血后再灌注神經細胞凋亡的影響

張 慧

（山西大同大學醫(yī)學院，山西大同 037009）

參蛇偏癱膠囊由人參、白花蛇、水蛭、鱉甲、鹿角膠等15味名貴中藥組成，具有益氣補腎，活血化瘀，熄風通絡之功效，臨床治療缺血性腦血管疾病療效較好[1-2]。研究顯示，凋亡是輕度腦缺血損傷中神經細胞死亡的重要過程，而Bcl-2可抑制這一過程[3]。本研究通過觀察這兩種常用藥物聯(lián)合使用對腦缺血的保護作用，及其與Bcl-2表達的影響來探討其保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 昆明種小鼠，由山西農業(yè)大學動物醫(yī)學實驗教學中心提供。

1.1.2 藥物 參蛇偏癱膠囊（粉），鄭州羚銳制藥有限公司生產（國藥準字：B20040027），1 g粉含飲片 4 g。尼莫地平片，石家莊市華龍制藥股份有限公司生產。

1.1.3 試劑 DNA原位末端標記試劑盒為上海索萊寶生物科技有限公司產品；Bcl-2免疫組化試劑為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組和模型制備 成年小鼠50只，月齡3個月，雌雄不拘，單只體重50～70 g，隨機分為5組，每組10只，即假手術組、模型組、尼莫地平組、參蛇偏癱膠囊組、參蛇偏癱膠囊聯(lián)合尼莫地平預處理組（聯(lián)合組）。結合Zea Longa等[4]和Chomczynski等[5]描述的方法，加以改動建立全腦缺血再灌注模型。小鼠3.5%水合氯醛（35 mg/100 g BW）腹腔注射麻醉后，分離雙側頸動脈并套以0號絲線，將雙側頸動脈同時結扎阻斷并確定無血流通過后，30 min后切斷絲線灌流10 min，再次阻斷30 min后，放開線，使血流再通。術后觀察行為、左側上肢屈曲、行走左轉或左側跌倒者手術成功。

1.2.2 給藥與取樣 模型組給予腦缺血5 min后再灌注72 h，尼莫地平組在缺血前30 min靜脈給予尼莫地平0.2 mg/kg；參蛇偏癱膠囊組在缺血前30 min腹腔注射參蛇偏癱膠囊混懸液10 ml/kg；聯(lián)合組缺血前30 min腹腔注射參蛇偏癱膠囊混懸液10 ml/kg，同時給予靜脈注射尼莫地平0.2 mg/kg。假手術組僅分離頸部血管，各組均在腦缺血后5 min再灌注72 h后取腦組織。

1.2.3 凋亡細胞檢測 依據(jù)Gavrieli等[6]描述的方法將DUTP生物素化后標記到DNA片段上，該生物素通過與親合素的特異性結合，使該聯(lián)合體結合在DNA的斷點部位，加入過氧化物酶顯色底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）后，在原位出現(xiàn)棕褐色沉淀，著色者為凋亡細胞。

1.2.4 Bcl-2檢測 Bcl-2多抗孵育后，依次滴加抗兔IgG、鏈霉卵白素（辣根酶標記）等試劑后孵育。陰性對照是用正常血清代替一抗，以已知陽性切片為陽性對照。觀察Bcl-2免疫組化結果，根據(jù)文獻[7]判定，陽性細胞的征象是胞漿內或核膜上出現(xiàn)棕黃色斑片或顆粒。高倍顯微鏡視野記計數(shù)200個神經元細胞中的陽性細胞比例，其中陰性為無神經元細胞著色，弱陽性＜25%著色，中強度陽性25%～50%著色，反應強度分別記 0、1、2、3 分。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，方差不齊時采用近似t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組預處理后著色細胞變化的比較

見表1。由表1可知，聯(lián)合組著色細胞率明顯低于其他組（P＜0.05），假手術組無陽性細胞表達；尼莫地平組和參蛇偏癱膠囊組著色細胞率低于模型組（P＜0.05），但與聯(lián)合組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組預處理后Bcl-2表達變化的比較

見表1。由表1可知，模型組鼠皮質區(qū)錐體細胞呈弱陽性，而聯(lián)合組皮質區(qū)Bcl-2蛋白免疫反應為強陽性，兩組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與尼莫地平組、參蛇偏癱膠囊組比較，差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05、P＜0.01）。

3 討論

凋亡是腦缺血損傷后神經細胞死亡的重要方式，且多發(fā)生在缺血再灌注24 h后，是遲發(fā)性神經元死亡的主要形式。細胞凋亡需要多種基因、蛋白的參與，其特征是DNA的有序降解，TUNEL法可較早地、高度敏感地發(fā)現(xiàn)這些片段[8]。因此本實驗采用TUNEL法檢測動物皮質區(qū)缺血再灌注后的細胞凋亡情況。本研究結果顯示，腦缺血再灌注后出現(xiàn)皮質區(qū)錐體神經元的丟失現(xiàn)象，大量凋亡細胞呈現(xiàn)，提示細胞凋亡與遲發(fā)性神經元死亡的密切關聯(lián)。

表1 各組皮層區(qū)細胞著色情況比較（±s）Tab.1 Comparison of colored situation cortex cells in each group(±s)

表1 各組皮層區(qū)細胞著色情況比較（±s）Tab.1 Comparison of colored situation cortex cells in each group(±s)

與模型組比較，#P＜0.05；與聯(lián)合組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，△P＞0.05Compared with the model group,#P＜0.05;compared with the combination group,*P＜0.05，**P＜0.01，△P＞0.05

組別 只數(shù) 著色細胞數(shù)（%）假手術組模型組尼莫地平組參蛇偏癱膠囊組聯(lián)合組10 10 10 10 10 0 72.4±2.2*38.0±1.9*#△42.4±3.6*#△18.7±3.1反應強度（分）0.10±0.50 0.90±0.54**1.70±0.33*1.30±0.78**2.70±0.39

研究表明，Bcl-2在抗細胞凋亡作用中發(fā)揮重要作用，這種作用是多途徑的[9]。Bcl-2的蛋白表達量與腦保護作用成正比。本研究結果表明，尼莫地平預處理組的Bcl-2蛋白反應強度大于假手術組，提示采用尼莫地平進行預處理有可能導致Bcl-2基因表達增強，從而減少凋亡細胞數(shù)。既往藥理學研究成果顯示，參蛇偏癱膠囊君藥人參的成分對腦缺血損傷具有較好的保護作用，本研究結果亦提示參蛇偏癱膠囊對鼠腦缺血起到了保護作用。通過以上的分析，推測這種保護作用機制可能與其增強Bcl-2的表達和抑制BaX蛋白的表達，在某種程度上干預了細胞凋亡進程有關。

參蛇偏癱膠囊與尼莫地平聯(lián)合使用是否會產生協(xié)同效應，本實驗通過比較經兩者單獨使用及聯(lián)合預處理后的皮層區(qū)神經元的凋亡細胞百分率，可以看出參蛇偏癱膠囊聯(lián)合尼莫地平預處理的效果由于二者單獨使用。這提示，藥物聯(lián)合應用可能是腦缺血損傷治療的一條有效模式。

[1]張振強,荊志偉,樊小勇,等.參蛇偏癱膠囊對局灶腦缺血大鼠腦保護作用的實驗研究[J].中成藥,2006,28(9)∶1059-1060.

[2]荊志偉,韓群英,張振強,等.參蛇偏癱膠囊預防短暫性腦缺血發(fā)作的隨機對照研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2006,33(6)∶641-642.

[3]Basuroy S,Bhattacharya S,Leffler CW,et al.Akt/Bcl-2 signaling is critical for anti-apoptotic effects of carbon monoxide(CO)against TNF-alpha-mediated inflammatory damage in cerebral vascular endothelial cells[J].FASEB J,2010,24(4)∶979.

[4]Zea Longa E,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)∶84-91.

[5]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol chloroform extraction[J].Anal Biochem,1987,162(1)∶156-159.

[6]Gavrieli Y,Sherman Y,Ben Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of DNA fragmentation[J].J Cell Biol,1992,119∶493-501.

[7]張予陽,史琳琳,郝冬海,等.Bcl-2在缺血性神經細胞損傷中的作用及藥物的影響[J].中國藥理學通報,2010,26(1)∶21-24.

[8]Muratori M,Tamburrino L,Tocci V,et al.Small variations in crucial steps of TUNEL assay coupled to flow cytometry greatly affect measures of sperm DNA fragmentation[J].J Androl,2010,31(6)∶336-345.

[9]Zhang YY,Dong YL,Wu X,et al.The mitochondrial pathway of anesthetic isoflurane-induced apoptosis[J].J Biol Chem,2010,285(2)∶4025-4037.