高血壓患者頸動脈粥樣硬化與血清中sICAM-1水平及K469E基因多態性的相關性研究

林秋偉，陳富榮，陳海生，李東風

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405；2.廣東省人民醫院，廣東廣州 510108)

動脈粥樣硬化是當今世界威脅人類健康的主要疾病之一，頸動脈位置表淺，已被證實可作為反映全身動脈粥樣硬化情況的“窗口”。目前研究普遍認為在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，病變局部的非特異性炎癥反應起了重要作用。研究表明，ICAM-1基因多態性與炎癥成分參與的多因素疾病的發生發展密切相關，但目前在ICAM-1基因多態性與頸動脈粥樣硬化相關性目前尚無定論[1-2]。為此本文旨在探索ICAM-1基因多態性與頸動脈粥樣硬化的關系，為頸動脈粥樣硬化的發病機制提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象

201 例高血壓患者中，男112例，女89例；平均年齡（59.3±8.7）歲。高血壓按照世界衛生組織收縮壓≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），舒張壓≥90 mm Hg診斷標準，并除外合并嚴重感染、腎功能不全、甲狀腺疾病、肝臟疾病、糖尿病、冠心病、繼發性高血壓及結締組織病、心衰、癌癥等患者。

1.2 方法

1.2.1 基因型分析 取靜脈全血2 ml，應用高鹽沉淀法提取基因組dNA。PCR方法擴增目的片斷。引物序列為：5′-GGGGCTGTGGGGAGGATA-3′（正義鏈） ;5-CCCCGACTGGACGAGAGG-3′（反義鏈）；ICAM-1的 PCR 擴增反應體系均為 50 μl， 其中含 10×PCR 緩沖液 5 μl，dNTPs 5 μl，引物P1、P2 各 1 μl，模板dNA 5 μl，TaqDNA 聚合酶 1 U。 置熱循環儀中94℃預變性5 min；再按下列程序循環35次，即94℃變性 45 s，72℃退火 45 s，72℃延伸 45 s；末次循環后，72℃延伸5 min[3]。

1.2.2 擴增產物的限制性酶切 取PCR擴增產物10 μl，加入由NEB公司生產的BstUⅠ內切酶10 U，置恒溫水浴箱中水浴6 h。取PCR酶切產物10 μl在3%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，染色后經紫外燈判斷結果并拍照。

1.2.3 血清ICAM-1水平的檢測 采用酶聯免疫吸附實驗測定ICAM-1血清水平，每次測定均嚴格按說明書操作[4]。

1.2.4 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件?；蛐图暗任换蝾l率采用基因計數法計算，計算各等位基因頻率分布，吻合度檢查確定是否符合Hardy－Weinberg平衡定律；計量資料兩均數比較采用t檢驗，多均數比較采用方差分析；多元逐步回歸分析頸總動脈有關指標的影響因素；因素相關性采用Spearman等級相關或Pearson相關分析[5]。

2 結果

2.1 ICAM-1基因型分析

ICAM-1第6外顯子A＞G的點突變導致編碼的第469氨基酸賴氨酸（K）到谷氨酸（E）的改變。ICAM-1 PCR擴增產物片段大小為223 bp，根據限制性內切酶BstUⅠ酶切片段的情況，基因型有3種，KK型（223 bp 1條帶），EK型（223 bp、136 bp、87 bp 3 條帶）， EE 型（136 bp、87 bp 2 條帶）。 本實驗中，對照組和EH組均可見到三種基因型，即KK型，EK型和EE型。經χ2檢驗，對照組和EH組的基因型分別均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律， 對照組 （χ2＝0.25，df＝1，P＞0.05），EH 組（χ2＝0.316，df＝1，P＞0.05），表明來自同一人群，說明研究結果具有群體代表性。電泳結果見圖1。

2.2 ICAM-1基因各基因型在對照組和EH組中的分布

正常組 KK、KE、EE 基因型頻率分別為 0.491、0.434、0.075； 高血壓組 KK、KE、EE基因型頻率分別為 0.512、0.418、0.070，基因構成無顯著性差異（χ2=0.141， P＞0.05）。 正常組K等位基因頻率為0.708，E等位基因頻率為0.292；高血壓組K等位基因頻率為0.721，E等位基因頻率為0.297，基因頻率亦無顯著性差異（χ2=0.131，P＞0.05）。

2.3 高血壓組不同ICAM-1基因型頸總動脈相關指標比較

高血壓組不同ICAM-1基因型頸總動脈內膜-中膜厚度、管腔內徑（D）及管腔內徑與壁腔比值（I/D）比較，其中KE+EE基因型組頸總動脈IMT、I/D比值顯著高于KK基因型組 （P＜0.05和P＜0.01），KK基因型組頸總動脈管腔內徑與KE＋EE基因型組無顯著性差異（表1）。

表1 高血壓組不同ICAM-1基因型頸總動脈相關指標比較（±s）Tab.1 Comparison of index of correlation of thedifferent ICAM-1gene polymorphisms arteria carotis communis in EHgroup(±s)

表1 高血壓組不同ICAM-1基因型頸總動脈相關指標比較（±s）Tab.1 Comparison of index of correlation of thedifferent ICAM-1gene polymorphisms arteria carotis communis in EHgroup(±s)

項目 KK基因組 KE＋EE基因組P值例數年齡（歲）吸煙（%）收縮壓（mm Hg）舒張壓（mm Hg）BMI（cm）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）HDL（mmol/L）GLU（mmol/L）IMT（mm）D（mm）I/D 103 58.6±12.6 34.0 165.3±30.1 87.2±20.4 25.64±5.21 5.02±0.96 1.41±0.11 3.05±0.14 1.25±0.72 5.21±0.14 0.89±0.21 8.23±0.95 0.11±0.02 98 59.8±14.5 39.2 161.8±36.2 89.1±22.4 26.98±5.87 4.89±0.88 1.44±0.13 3.01±0.09 1.18±0.81 5.07±0.18 1.13±0.13 8.19±1.11 0.14±0.02＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05<0.05＞0.05＜0.01

2.4 頸動脈內膜-中膜厚度（IMT）相關因素分析

高血壓組頸總動脈內膜-中膜厚度回歸分析：將收縮壓、舒張壓、TG、TC、LDL-C、HDL、年齡、體重指數、吸煙以及ICAM-1基因型做逐步回歸分析結果顯示，年齡是頸動脈內膜-中膜厚度的主要影響因素（B=0.197，P＜0.05）；ICAM-1 基因型也是頸總動脈內膜-中膜厚度的一個影響因素（B=0.192，P＜0.05）[7-8]。

3 討論

心腦血管疾病是危害人類健康的嚴重疾病，動脈粥樣硬化無疑是引起心腦血管疾病的首要原因。頸動脈位置表淺，已被證實可作為反映全身動脈粥樣硬化情況的 “窗口”。頸動脈IMT直接反映頸動脈粥樣硬化的程度，Salonen等報道頸總動脈的最大中層內膜（IMT）厚度與發生急性心肌梗死的危險度顯著相關，所以頸動脈IMT增加是一種早期反映動脈粥樣硬化的無創性指標[9]。目前研究普遍認為，動脈粥樣硬化的發生發展是一個緩慢而復雜的過程，其發病機制牽涉多種因素，高血壓是頸動脈內膜增厚、斑塊形成的重要因素[10]，但長期隨訪發現經降壓治療血壓維持正常的高血壓患者與正常血壓者相比仍有較高的心血管病發生率，說明動脈粥樣硬化是復雜的、多因素參與的動態過程。目前研究普遍認為，在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，病變局部的非特異性炎癥反應起了重要作用[11]，而此類炎癥反應是通過多種炎癥介質產生，ICAM-1是其中一種。盡管ICAM-1在介導白細胞間黏附聚集、白細胞外滲、白細胞與內皮細胞間黏附等過程中的作用已被詳細闡明[7]，但是ICAM-1的基因多態性與高血壓頸動脈粥樣硬化相關機制還不清楚。已有學者對周圍動脈閉塞性疾病及多發性硬化患者進行基因分析，發現周圍動脈閉塞性疾病患者EE基因型比對照組明顯增加[12]。這表明ICAM-1基因多態性與炎癥成分參與的多因素疾病的發生發展密切相關。我們對中國廣東地區307例漢族人（高血壓患者201例，正常對照106例）的研究結果顯示，高血壓組和對照組的E、K等位基因頻率，分別為 0.292、0.708和 0.279、0.721，比較無顯著性差異（χ2=0.131，P=0.717 4）。另外筆者對201例高血壓患者進行ICAM-1基因K469E多態性進行分析發現，高血壓患者EK和EE基因型組平均IMT高于KK基因型組。即KE+EE基因型高血壓患者頸總動脈硬化程度比KK純合子顯著，E等位基因攜帶者可能是高血壓病發生動脈硬化的一個易感因素。多元逐步回歸分析也提示，E等位基因是原發性高血壓患者動脈硬化的影響因素，但其作用可能不如年齡及血壓、血脂對動脈硬化作用大，是獨于傳統的易患因素如高血壓、高脂血癥等之外的一個因素，確切的機制和影響因素有待于進一步探討。

同時，筆者也對高血壓與血清中可溶性ICAM-1進性了探討，結果顯示在控制其他危險因素及排除高血壓嚴重并發癥的干擾后，發現高血壓患者sICAM-1濃度與頸動脈病變程度呈正相關，即隨著頸動脈病變的加重，sICAM-1濃度增高。說明高血壓患者血液中sICAM-1濃度增高與頸動脈損傷、粥樣硬化形成密切相關，因而在除外其他炎癥反應的情況下，sICAM-1的水平可間接反映頸動脈粥樣硬化的程度。

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