β-乳球蛋白IgE抗原決定簇的識別

叢艷君，任發政，云戰友

(1.北京工商大學化學與環境工程學院，北京 100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010080)

β-乳球蛋白IgE抗原決定簇的識別

叢艷君1，任發政2,*，云戰友3

(1.北京工商大學化學與環境工程學院，北京 100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010080)

以β-乳球蛋白氨基酸序列為模板，錯位合成β-乳球蛋白多肽，以收集到的牛乳過敏患者血清為抗體，鑒定β-乳球蛋白IgE抗原決定簇，分析影響致敏性的關鍵氨基酸，探討牛乳過敏機理。結果表明：β-乳球蛋白IgE抗原決定簇有4條，氨基酸序列分別為17～31、72～86、92～106、152～166，并且蘇氨酸(AA20)、蛋氨酸(AA23)、天冬氨酸(AA27)是影響β-乳球蛋白致敏性的關鍵氨基酸。說明特異性水解抗原決定簇或定點修飾氨基酸可以實現過敏原脫敏的目的。

牛奶；β-乳球蛋白；IgE；抗原決定簇

Abstract：A series of overlapping decapeptides (offset by five amino acids) were synthesized on the basis of the amino acid sequence of β-lactoglobulin. IgE-binding epitopes were identified using individual sera from cow milk allergic patients. In addition,we also identified critical amino acids (AAs) for IgE binding. The results showed that four IgE-binding epitopes were identified,which located in the sequences of AA 17－31, AA 72－86, AA 92－106 and AA 152－166, respectively. Threonine,methionine and aspartic acid were the critical amino acids for allergenicity of β-lactoglobulin.

Key words：cow milk；β-lactoglobulin；IgE；epitope

β-乳球蛋白占牛乳總蛋白的10%，乳清蛋白的50%。IgE介導的牛乳過敏中60%的病人對β-乳球蛋白過敏[1]。β-乳球蛋白一般是二聚體，其每個單位為18kD，含有162個氨基酸，5個二硫鍵，其中4個為鏈內，1個為鏈間。有關牛乳過敏原表位的研究在2000年左右最為活躍，其內容涉及到對B細胞表位(包括IgE表位和IgG表位)及T細胞表位的研究。Sélo等[2]在研究β-乳球蛋白時，確定了人的主要IgE表位為肽鏈1～8、25～40、41～60、102～124、149～162 位，同時21～40、42～60、107～117、148～162位也被致敏的大鼠所識別。而Fritsché等[3]研究表明：β-乳球蛋白氨基酸序列41～60、102～124、149～162位，這3個表位被90%～100%過敏患者的血清所識別，是主要過敏表位，肽鏈1～8、25～40、92～100位，被50%～65%過敏患者血清IgE所識別，為次要過敏表位。目前對β-乳球蛋白的IgG表位研究則較少，只確定了6個識別位點：肽鏈1～16、51～64、67～88、85～96、129～144、139～156位，其中1～16位和58～96位為次要識別位點，其余為主要識別位點[4]。關于β-乳球蛋白抗原決定簇的關鍵氨基酸的研究報道很少。

各國牛乳患者過敏血清不同，本研究收集中國牛乳過敏患者血清，鑒定β-乳球蛋白IgE抗原決定簇及影響致敏性的關鍵氨基酸，以期為牛乳過敏的臨床診治及低過敏牛乳制品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-乳球蛋白、HRP標記的鼠抗人IgE(ε鏈特異性)、四甲基聯苯胺(TMB)、三氟乙酸(TFA) 美國Sigma公司；鏈霉親和素(SA) 北京博奧森生物技術有限公司；96孔聚苯乙烯酶標板 美國Costar公司。

1.2 儀器與設備

Bio-Rad550型酶標儀 美國Bio-Rad公司；PSH500A生化培養箱 中國重慶銀河實驗儀器有限公司；F-32酸度計 日本崛廠制作公司；Th-80D-2B型凍干機 北京天地精儀科技有限公司；高效液相Vydac C18柱 美國Vydac公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成

采用Fmoc固相肽合成法[5]，將C-末端氨基酸連接到一種合適的固相載體上，采用常規Fmoc法進行逐步縮合。合成結束后，用強酸將序列從固相載體上切割下來，經HPLC純化，冷凍干燥后備用。

1.3.2 合成多肽的純化和鑒定

采用高效液相色譜(RP-HPLC)和質譜進行分析。色譜條件：色譜柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：A為體積分數0.1%TFA的溶液，B為乙腈，采用按體積分數梯度洗脫程序：0～5min，15% B；5～10min，20% B；10～30min，40% B。流速：1.0mL/min；檢測波長：220nm；柱溫：20℃。質譜條件：采用ESI離子源，噴霧壓力：15psi；干燥氣溫度：350℃；流速：5L/min；掃描質量范圍：m/z 500～2200u。

1.3.3 牛乳過敏患者血清的收集

按照文獻[2]相關參數(典型的食物過敏史、皮膚點刺實驗、Immunol CAP實驗)篩選牛乳過敏患者血清。6份牛乳過敏患者血清用來識別β-乳球蛋白IgE抗原決定簇，以A～F表示。另外取5份血清等體積混合分析影響β-乳球蛋白致敏性的關鍵氨基酸。

1.3.4 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)鑒定抗原決定簇及關鍵氨基酸

合成多肽致敏性的檢測在96孔微板上進行，每孔均先用鏈霉親和素包被，分別依次加入待進行抗原決定簇鑒定的肽系列，再用抗體檢測，具體操作參考文獻[6]。

2 結果與分析

2.1 β-乳球蛋白肽的合成

以β-乳球蛋白氨基酸序列為模板，用Fmoc固相合成法錯位合成β-乳球蛋白多肽30條(錯位氨基酸為5個)，見表1。

表1 合成多肽氨基酸序列Table 1 Amino acid sequence of synthesized peptides

2.2 合成多肽的純化及鑒定

合成的多肽通過高效液相純化，純度都達到了80%以上，進一步通過質譜鑒定多肽的相對分子質量(加上生物素的相對分子質量)，表明多肽相對分子質量誤差均小于5%。本實驗代表性的附上了兩條多肽(偶聯生物素)的質譜圖(圖1、2)。

圖1 Biotin-LIVTQTMKGLDIQKV多肽的MS圖譜Fig.1 MS spectrum of the peptide containing LIVTQTMKGLDIQKV sequence coupled with biotin

圖2 Biotin-TKIPAVFKIDALNEN多肽的MS圖譜Fig.2 MS spectrum of the peptide containing TKIPAVFKIDALNEN sequence coupled with biotin

2.3 β-乳球蛋白IgE抗原決定簇的識別

由圖3可知，A患者識別到的抗原決定簇為B01、B04、B07、B12、B16、B20、B25、B26；B 患者識別到的抗原決定簇為B01、B03、B09、B12、B14、B20、B26、B30；C患者識別到的抗原決定簇為B01、B02、B05、B10、B14、B16、B19、B25、B28、B29；D患者識別到的抗原決定簇為B01、B04、B07、B12、B16、B23、B28、B30；E患者識別到的抗原決定簇為B01、B06、B12、B15、B22、B28；F患者識別到的抗原決定簇為B01、B02、B04、B07、B12、B16、B20、B26、B28。

表2 IgE抗原決定簇在β-乳球蛋白序列中的定位Table 2 Location of IgE-binding epitopes on β-lactoglobulin

圖3 A～F牛乳過敏患者識別β-乳球蛋白IgE抗原決定簇Fig.3 Identification of immunodominantβ-lactoglobulin epitopes from cow milk allergic patients numbered A through F

本研究以牛乳過敏患者血清反應率為65%以上的多肽為抗原決定簇。由圖3可知，編號為B01多肽的識別率為100%(6/6，即與6份血清均發生免疫反應)；B12的識別率為83.3%(5/6)；B16、B28的識別率為66.7%(4/6)；B04、B07、B20、B26的識別率為50%(3/6)；個別個體血清對B03、B05、B09、B10、B29、B30發生免疫反應。因此，B01、B12、B16、B28為抗原決定簇，其氨基酸序列分別為LIVTQTMKGLDIQKV、ILLQKWENGECAQKK、TKIPAVFKIDALNEN、FDKALKALPMHIRLS。4條抗原決定簇在β-乳球蛋白氨基酸序列中的定位分別為17～31、72～86、92～106、152～166，結果見表2粗體部分。多肽17～31識別率為100%，是顯性抗原決定簇。用非牛乳過敏患者血清識別抗原決定簇的OD450nm均低于0.1，本實驗未附陰性對照的具體數據。

2.4 β-乳球蛋白IgE顯性抗原決定簇(LIVTQTMK GLDIQKV)關鍵氨基酸的分析

為了找到影響致敏性的關鍵氨基酸，本研究選用分子較小的中性丙氨酸作為取代氨基酸。用丙氨酸依次取代LIVTQTMKGLDIQKV抗原決定簇的氨基酸，以未取代的抗原決定簇(AA17～31)作對照，由圖4可知，第25位的甘氨酸被丙氨酸取代后的多肽致敏性增強，第20位的蘇氨酸被丙氨酸取代合成的多肽、第23位蛋氨酸被丙氨酸取代合成的多肽及第27位的天冬氨酸被丙氨酸取代合成的多肽光密度值為零，多肽致敏性消失，其他氨基酸被丙氨酸取代后的多肽光密度值與對照相差不大。因此蘇氨酸(AA20)、蛋氨酸(AA23)、天冬氨酸(AA27)是影響β-乳球蛋白致敏性的關鍵氨基酸。

圖4 影響β-乳球蛋白致敏性的關鍵氨基酸Fig.4 Critical amino acids for allergenicity of β-lactoglobulin

3 討 論

Ⅰ型速發型超敏反應一般是由IgE介導的，鑒定牛乳過敏原IgE抗原決定簇，對于指導臨床診治牛乳過敏疾病及降低牛乳過敏原的致敏性均具有重要意義。有研究表明，在臨床診斷牛乳過敏疾病時，發現αs1-酪蛋白抗原決定簇的特異性IgE抗體[7]。

人乳中β-乳球蛋白含量幾乎為零，但是β-乳球蛋白與一些人類及動物lipocalin蛋白家族具有同源性。據報道這一類蛋白具有強致敏性，許多動物源性過敏原，如馬的主要過敏原Equ c1、幾種主要的鼠源性尿蛋白等都屬于這類蛋白[8]。

早在乳蛋白的水解物中就發現了β-乳球蛋白的致敏片斷[9-11]。本研究通過化學合成多肽的方法分析抗原決定簇，用6位牛乳過敏患者血清識別到β-乳球蛋白IgE抗原決定簇4條，其氨基酸序列分別為LIVTQTMKGLDIQKV、ILLQKWENGECAQKK、TKIPAVFKIDALNEN、FDKALKALPMHIRLS。其中識別率最高的LIVTQTMKGLDIQKV位于β-乳球蛋白的第17～31位，主要是由疏水性氨基酸構成，可能位于乳球蛋白的內部，在外界因素處理條件下才有可能暴露出來，而之前研究發現的抗原決定簇多位于分子表面的親水性片段(AA124～134)[7,9-10]。氨基酸序列為AA17～31的IgE抗原決定簇位于β-乳球蛋白的N端，是顯著區別于其他科屬蛋白的保守序列，抗原決定簇AA152～166位于β-乳球蛋白的C端，與其他乳源蛋白序列具有相似性，此結論很好的解釋了乳蛋白之間存在的免疫交叉反應性的原因。Ball等[12]發現的肽鏈97～108和Heinzmann等[11]識別的肽鏈95～113與本研究識別的肽鏈92～106抗原決定簇相一致。另外，本研究還識別到ILLQKWENGEC AQKK(AA72～86)和FDKALKALPMHIRLS(AA152～166)兩條抗原決定簇，這在其他研究中尚未見報道。

找到IgE結合的關鍵氨基酸，通過基因工程或氨基酸修飾的方法降低過敏原致敏性是當前學者致力研究重點?；ㄉ^敏原Ara h1、Ara h2和Ara h3取代單個氨基酸可以實現IgE結合能力喪失或降低[8-10]，而蝦過敏原Pen a1需要取代兩個以上氨基酸才能實現脫敏的目的[12]。本研究表明通過取代單個氨基酸可以實現β-乳球蛋白IgE結合能力的喪失，進而可以通過基因工程或氨基酸修飾的方法降低β-乳球蛋白致敏性，為低過敏嬰兒配方粉的開發提供依據。

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Identification of IgE-binding Epitopes on β-lactoglobulin

CONG Yan-jun1，REN Fa-zheng2,*，YUN Zhan-you3
(1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；3. Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd., Hohhot 010080, China)

TS252.1

A

1002-6630(2010)15-0190-04

2009-11-18

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD04A06)

叢艷君(1978—)，女，講師，博士，主要從事乳蛋白質結構與功能研究。E-mail：congyj@th.btbu.edu.cn

*通信作者：任發政(1962—)，男，教授，博士，主要從事功能乳制品研究。E-mail：renfazheng@263.net