刺參對運動小鼠抗疲勞作用的研究

李 冰，王靜鳳，傅 佳，李曉林，李 輝，趙 芹，薛長湖*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

刺參對運動小鼠抗疲勞作用的研究

李 冰，王靜鳳，傅 佳，李曉林，李 輝，趙 芹，薛長湖*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

研究北方養(yǎng)殖刺參的主要活性成分和對運動小鼠抗疲勞的作用。結果表明：養(yǎng)殖刺參體壁富含酸性黏多糖、膠原蛋白、活性氨基酸和活性脂質等多種活性成分，能提高小鼠負重游泳能力、肝糖元含量和安靜狀態(tài)下小鼠血紅蛋白含量，保持運動小鼠血紅蛋白水平穩(wěn)定，顯著降低運動小鼠血乳酸的生成，促進運動后血乳酸的消除，加速運動血清尿素氮的清除。說明養(yǎng)殖刺參具有顯著的抗疲勞和提高運動耐力的作用。

養(yǎng)殖刺參；抗疲勞；肝糖原；血乳酸；血清尿素氮

Abstract ：This paper describes the bioactive composition of cultured sea cucumber Stichopus japonicus and its anti-fatigue effect in mice. The results indicated that body wall of S. japonicus was rich in acidic mucopolysaccharides, collagen, bioactive amino acids and lipids. In comparison with the control group, administration of Stichopus japonicus for 30 consecutive days prolonged the duration of exhaustive swimming in mice weighted with weights (approximately 5% of body weight), promoted the synthesis of liver glycogen and hemoglobin and kept a level of hemoglobin 90 min post-swimming similar to that before swimming, significantly decreased the generation of blood lactic acid and accelerated the elimination of blood lactic acid and blood urea nitrogen in mice after swimming. Based on these investigations, S. japonicus has an obvious anti-fatigue effect and improves exercise endurance in mice.

Key words：cultured Stichopus japonicus；anti-fatigue；liver glycogen；blood lactic acid；blood urea nitrogen

運動性疲勞既與體內內源性物質的消耗有關，也與神經、內分泌以及免疫系統(tǒng)的平衡調節(jié)相關。海參為棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirota)動物，是海洋中重要的食物和藥物資源。現已證明，海參體壁中含有海參多糖、海參皂苷、海參膠原蛋白肽、海參腦苷酯、神經節(jié)苷酯等多種生物活性物質[1]，這些活性物質作為生物信息分子對人類生理功能的調節(jié)起著重要的信號轉導作用，具有提高免疫功能、抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂、抗衰老等多種生理功效[2-5]。海參的種類和來源不同，因生活環(huán)境和所攝食物各異，致使其營養(yǎng)成分和功效存有差異。本實驗擬在前期工作的基礎上，以北方養(yǎng)殖刺參為研究對象，分析養(yǎng)殖刺參的主要成分及其對運動小鼠抗疲勞作用的影響，以期為養(yǎng)殖刺參的深度開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

養(yǎng)殖刺參，購自青島市膠南養(yǎng)殖場，經本院中試實驗基地加工成干制刺參。用于成分分析的刺參，經粉碎后備用。用于動物實驗的刺參，分別制成勻漿，－40℃貯存，實驗時以蒸餾水配成所需濃度懸濁液。Balb/c小鼠，雄性，體質量(18±1)g，SPF級，由北京維通利華實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(京)2007 — 0001。

糖原試劑盒、尿素氮試劑盒、乳酸試劑盒 南京建成科技有限公司；巖藻聚糖硫酸酯 美國Sigma公司；木瓜蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純或以上級別。

CA-958D型半自動生化分析儀 長春光機醫(yī)療儀器有限公司；Model 680型酶標儀 Bio RAD公司；835-50型氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白含量分析

采用凱氏定氮法測定[6]。

1.2.2 膠原蛋白含量分析

刺參經水解后，采用比色法測定其中羥脯氨酸含量，再經系數折算的方法測定膠原蛋白含量[7]。

1.2.3 酸性黏多糖含量分析

將刺參以木瓜蛋白酶酶解24h后，經離心、上清液定容，采用次甲基藍法測定[8]。

1.2.4 總脂質含量分析

總脂質含量測定采用Folch法[9]。將刺參切碎，用氯仿:甲醇(2:1，V/V)勻漿，用乙酸鋅靜置過夜分層。收集下層氯仿層，無水硫酸鈉脫水后過濾，真空旋蒸至干，所得殘余物即為總脂質。氮氣吹旋蒸瓶至質量恒定后稱質量，旋蒸瓶增加的質量即為總脂質質量，除以原料質量即為總脂質含量。

1.2.5 總脂質組成成分分析

脂肪組分的測定采用硅膠柱層析法[10]。采用濕法裝柱，將活化后的硅膠緩緩倒入層析柱(30cm×2.1cm)中，靜置30min待硅膠柱穩(wěn)定后，將含200～300mg總脂質的少量氯仿溶液上樣，依次用氯仿洗脫中性脂、丙酮洗脫糖脂、甲醇洗脫磷脂，各自單獨收集后旋蒸至干、稱質量。得到各脂肪組分質量。

1.2.6 氨基酸組成分析

刺參準確稱量(精確到0.0001g)，經6mol/L HCl 溶液水解，采用氨基酸自動分析儀對其主要氨基酸組成進行分析。

1.2.5 動物分組及實驗

Balb/c小鼠共4批，每批小鼠隨機分為正常對照組和海參低、中、高劑量組，每組10只，分別測定負重游泳時間、血清尿素氮與血紅蛋白含量、肝糖原含量、血乳酸含量。劑量組小鼠分別灌胃不同劑量的刺參(劑量分別為100、200mg/(kg bw·d)和400mg/(kg bw·d))。正常對照組小鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積為0.1mL/10g bw，連續(xù)30d。于末次灌胃后1h進行實驗。

1.2.5.1 負重游泳實驗

將各組小鼠分別稱質量、編號，尾部各負一重物(約為體質量的5%)。分別把小鼠放入玻璃水族箱(50cm×30cm×40cm)，水深為30cm，水溫保持在(25±0.5)℃中游泳，以小鼠頭部沉入水中10s不能浮出水面者為體力耗竭，記錄小鼠自游泳開始至體力耗竭的時間，作為小鼠游泳時間。

1.2.5.2 血清尿素氮的測定

使小鼠在30℃的水中無負重游泳。分別于游泳前、游泳90min休息60min等不同時間，眼眶靜脈叢采血，分離血清。按試劑盒法測定血清尿素氮含量。

1.2.5.3 血紅蛋白水平測定

使各組小鼠分別在30℃的水中無負重游泳。分別于游泳前、游泳90min等不同時間，眼眶靜脈叢取血，按照試劑盒法測定小鼠血紅蛋白含量。

1.2.5.4 肝糖原含量測定

使各組小鼠分別在30℃的水中無負重游泳。分別于游泳前、游泳10min、游泳90min等不同時間脫頸椎處死小鼠，取肝臟。按照試劑盒法測定小鼠肝糖原含量。

1.2.5.5 血乳酸含量測定

使各組小鼠分別在30℃的水中無負重游泳。分別于游泳前、游泳10min、游泳10min休息20min等不同時間，眼眶靜脈叢采血，按照試劑盒法測定小鼠全血乳酸含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據分析采用SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析，并以LSD法進行兩兩比較，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義上的差異。實驗結果用±s表示。

2 結果與分析

2.1 刺參的主要活性成分

化學分析結果表明，刺參體壁中蛋白、膠原蛋白、酸性黏多糖、總脂質的含量分別為72.7%、52.1%、14.9%和4.24%。總脂質中中性脂、糖脂和磷脂含量分別占26.1%、30.1%和43.8%。

表1 刺參體壁氨基酸的組成和含量Table 1 Amino acid composition of body wall of Stichopus japonicus

由表1可見，除色氨酸和胱氨酸因水解時被破壞，共檢測出16種氨基酸，總含量為67.1%，以Gly、Glu、Asp、Arg等藥效氨基酸含量為高。必需氨基酸、支鏈氨基酸和藥效氨基酸分別占氨基酸總量的29.3%、16.1%和64.2%。

2.2 對小鼠負重游泳耐力的影響

表2 刺參對小鼠負重游泳時間及對運動小鼠血紅蛋白和血清尿素氮含量的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Stichopus japonicus on the duration of weightloaded exhausive swimming and the contents of hemoglobin and blood urea nitrogen in mice (± s，n=10)

表2 刺參對小鼠負重游泳時間及對運動小鼠血紅蛋白和血清尿素氮含量的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Stichopus japonicus on the duration of weightloaded exhausive swimming and the contents of hemoglobin and blood urea nitrogen in mice (± s，n=10)

注：*.與正常對照組相比，差異顯著(P＜0.05)；**.與正常對照組相比，差異極顯著(P＜0.01)；#.與游泳前相比，差異顯著(P＜0.05)；##.與游泳前相比，差異極顯著(P＜0.01)。下同。

組別 負重游泳時間/min 血紅蛋白/(g/L) 血清尿素氮/( mmol/L)游泳前 游泳90min 游泳前 游90min休息60min正常對照組 7.38±2.43 145.7±8.94135.3±7.85#5.78±0.43 10.9±0.94##海參低劑量 13.8±3.24**155.5±3.74*150.7±6.85**5.41±0.75 6.46±0.81**#海參中劑量 15.4±3.15**158.9±12.4*152.7±7.72**5.38±0.84 6.36±0.57**#海參高劑量 13.1±4.38*158.8±9.79*152.9±7.51**5.65±0.89 6.76±0.80**#

由表2可見，不同劑量的刺參均能顯著提高小鼠負重游泳時間。與正常對照組比較，小鼠的平均負重游泳時間提高了91.1%，表明刺參能明顯提高小鼠的運動耐力。

2.3 對運動小鼠血紅蛋白含量的影響

由表2可見，不同劑量刺參均能顯著提高安靜狀態(tài)下小鼠體內血紅蛋白含量。當游泳開始后，隨著體力繼續(xù)消耗，正常對照組小鼠的血紅蛋白含量明顯下降，而刺參各組小鼠的變化不大，表明刺參能維持運動小鼠體內血紅蛋白含量的相對穩(wěn)定。

2.4 對運動小鼠血清尿素氮含量的影響

由表2可見，刺參對運動前安靜狀態(tài)下小鼠體內的血清尿素氮含量無顯著性影響。運動后，各組小鼠體內血清尿素氮含量都明顯增加。但與正常對照組比較，刺參組小鼠的血清尿素氮平均降低了40.15%。說明刺參能加速運動后血清尿素氮的清除。

2.5 對運動小鼠肝糖原含量的影響

表3 刺參對小鼠肝糖原和全血乳酸含量的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of Stichopus japonicus on the contents of liver glycogen and blood lactic acid in mice (±s，n=10)

表3 刺參對小鼠肝糖原和全血乳酸含量的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of Stichopus japonicus on the contents of liver glycogen and blood lactic acid in mice (±s，n=10)

組別 肝糖原/(mg/g) 血乳酸/(mmol/L)游泳前 游泳10min 游泳前 游泳10min游10min休息20min正常對照組 41.1±3.51 27.1±6.851.56±0.423.36±0.94 2.78±0.80海參低劑量 58.2±9.80**40.2±3.97**1.26±0.302.25±0.45* 1.93±0.62*海參中劑量 61.3±5.03**46.6±8.53**1.22±0.392.21±0.65* 1.82±0.58*海參高劑量 61.5±7.73**49.1±9.77**1.22±0.412.35±0.57* 1.80±0.52*

由表3可見，不同劑量刺參均能顯著提高運動前安靜狀態(tài)下小鼠的肝糖元含量，與正常對照組比較，平均提高了49.7%。運動后小鼠要消耗肝糖元來維持血糖水平穩(wěn)定，肝糖元含量隨游泳時間的延長而迅速降低。游泳10min后，刺參組小鼠肝糖元含量較正常對照組平均提高了29.1%，說明刺參能明顯延緩疲勞出現。

2.6 對運動小鼠血乳酸水平的影響

由表3可見，在游泳前安靜狀態(tài)時，刺參對小鼠全血乳酸含量無顯著性影響。游泳10min，各組小鼠全血乳酸含量均較安靜狀態(tài)下顯著提高。但與正常對照組比較，刺參能顯著降低運動小鼠全血乳酸含量，平均下降了30.1%。游泳10min休息20min后，不同劑量的刺參均能顯著降低運動后小鼠全血乳酸含量，較正常對照組平均降低了35.3%。說明刺參具有明顯的消除乳酸、促進疲勞恢復的作用。

3 討 論

本實驗對北方養(yǎng)殖刺參體壁的主要活性成分及其抗疲勞作用進行了研究。結果表明，養(yǎng)殖刺參體壁中富含酸性黏多糖、膠原蛋白、藥效和支鏈氨基酸、糖脂和磷脂等主要活性成分，具有顯著的抗疲勞作用。

疲勞最直接和客觀的表現是運動耐力下降，而力竭游泳時間是反映運動耐力的重要指標。負重游泳實驗結果表明，刺參能顯著提高小鼠的負重游泳時間，提高小鼠的運動耐力。血糖是影響長時間運動能力的重要限制性因素之一。肝糖元是血糖的貯存庫，在機體血糖降低時可迅速分解釋放入血，以維持血糖水平的穩(wěn)定[11]。實驗結果表明，刺參能顯著提高小鼠的肝糖元儲備，保證小鼠在運動過程中的供糖能力，從而延緩運動小鼠疲勞出現。乳酸是機體在激烈運動初期通過葡萄糖的無氧糖酵解途徑獲能的代謝終產物，乳酸在肌肉和血液中的堆積是運動性疲勞產生的主要原因之一。乳酸的消除有利于疲勞的恢復，提高小鼠的運動能力。實驗結果顯示，刺參能顯著降低運動小鼠血乳酸的生成和促進運動后血乳酸的消除。血紅蛋白的主要功能是運輸氧氣，其含量直接影響機體的運動耐力。實驗結果表明，刺參能維持運動小鼠體內血紅蛋白含量的相對穩(wěn)定，保證機體氧氣供應充足，進而促進機體有氧代謝的進行和乳酸的消除，提高運動耐力。血清尿素氮是蛋白質代謝的終產物，是評定機體對運動適應能力的重要指標之一。機體血清尿素氮含量隨運動負荷的增加而增加，機體對負荷的適應能力越差，血清尿素氮的增加就越明顯。實驗結果顯示，刺參能加速運動小鼠血清尿素氮的清除，顯著提高小鼠的運動適應能力。

自由基的生成是導致運動性疲勞的一個重要的因素。自由基以及脂質過氧化產物一方面引起線粒體膜脂和膜蛋白發(fā)生交聯(lián)，膜脂鏈縮短，引起線粒體膜流動性下降，膜的完整性破壞或者引起酶構象變化，亞基結構受損，致使ATP酶活性下降，機體分解利用ATP減少[12]；另一方面破壞了電子漏的受控機制使線粒體呼吸Ⅲ態(tài)出現電子漏，致使合成ATP的效率下降[13]。養(yǎng)殖刺參體壁的化學分析結果顯示，刺參體壁富含酸性黏多糖、膠原蛋白、活性脂質和活性氨基酸。有關海參酸性黏多糖的藥效學已進行了深入研究，證明海參酸性黏多糖能顯著提高紅細胞SOD活性，具有顯著的抗氧化作用。膠原蛋白是刺參體壁粗蛋白的主要成分，含有多種功能性活性肽，能有效清除超氧陰離子自由基和羥自由基，降低細胞MDA含量，提高細胞抗氧化能力，增強細胞膜的穩(wěn)定性[14-15]。刺參體壁的藥效氨基酸Gly、Glu、Asp、Arg具有抗疲勞活性。Gly是合成血紅蛋白的基本原料，是生血、補血的物質基礎；Gly和Glu是細胞合成谷胱甘肽的重要原料，谷胱甘肽在機體的抗氧化機制中起重要作用，尤其是還原型谷胱甘肽對于維持紅細胞膜的完整性以及血紅蛋白的運氧能力十分重要[16]。Glu是肌肉合成谷氨酰胺的前體物質，而谷氨酰胺能直接通過血腦屏障調節(jié)中樞神經系統(tǒng)的興奮性。另外，谷氨酰胺還能將運動時產生的氨運送到肝腎解毒，從而維持血氨濃度的穩(wěn)定，延遲中樞疲勞的出現。谷氨酰胺是糖異生供能的重要能源物質，在糖氧化供能不足的情況下，谷氨酰胺糖異生作用增強，從而提高運動能力[17]。L-Arg和L-Asp是較早提出的氨基酸抗疲勞產品，已經證明，Arg和Asp分別通過NO和促進脂肪氧化代謝途徑提高運動耐力[18-20]。

支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)作為必需氨基酸，不僅是合成機體蛋白質的原料，還具有顯著的抗疲勞作用[21]：能夠抑制血液中的色氨酸進入腦內，減少5-羥色氨的合成，減輕中樞疲勞；通過清除生成的過多自由基或阻斷線粒體膜上的自由基鏈式反應，保護心肌和骨骼肌的抗氧化功能，維持細胞膜的結構。另外，支鏈氨基酸能促進機體胰島素、生長激素的分泌[22]，從而加速肌肉蛋白質的合成，防止肌肉組織的降解，具有抗外周性疲勞作用，加快運動后機體的修復，具有糖的異生作用。黃金麗等[23]的研究表明，補充支鏈氨基酸可促進糖的異生作用，減少骨骼肌乳酸的積累，延緩疲勞的發(fā)生和促進運動后疲勞的消除。

另外，糖脂和磷脂是構成生物膜的重要脂質組分，具有參與造血、促進免疫功能、保持生物膜的結構和功能、促進大腦發(fā)育和提高反應能力、抗疲勞等重要生理功能[1]。

綜上所述，養(yǎng)殖刺參體壁中含有全面的抗疲勞活性物質，具有顯著的抗疲勞和提高運動耐力的作用。

[1] 宋迪, 吉愛國, 梁浩, 等. 刺參生物活性物質的研究進展[J]. 中國生化藥物雜志, 2006, 27 (5): 316-319.

[2] 王靜鳳, 王奕, 逄龍, 等. 日本刺參(Apostichopus japonicus)的抗腫瘤及免疫調節(jié)作用研究[J]. 中國海洋大學學報, 2007, 37(1): 93-96.

[3] 趙芹, 王靜鳳, 逄龍, 等. 三種海參的主要活性成分和免疫調節(jié)作用的比較研究[J]. 中國水產科學, 2008, 15(1): 154-159.

[4] 高森, 王靜鳳, 王玉明, 等. 冰島刺參調節(jié)血脂及其作用機制[J]. 武漢大學學報: 理學版, 2009, 55(3): 324-328.

[5] 逄龍, 王靜鳳, 王玉明, 等. 北極刺參多糖、皂苷和膠原蛋白多肽對血管內皮細胞的保護作用[J]. 中國藥科大學學報, 2007, 38(5): 437-441.

[6] 劉箭. 生物化學實驗教程[M]. 北京: 科學出版社, 2004: 9-13.

[7] SATTO M, KUNISAKI N, URANO N, et al. Collagen as the major edible component of sea cucumber (Stichopus japonicus)[J]. Food Chemistry and Toxicology, 2002, 67(4): 1319-1322.

[8] 劉紅英, 薛長湖, 李兆杰, 等. 海帶巖藻聚糖硫酸酯測定方法的研究[J]. 青島海洋大學學報, 2002, 32(2): 236-240.

[9] FOLCH J, LEES M, SLOANE STANLEY G H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J].Journal of Biological Chemistry, 1957, 226(1): 497-509.

[10] 張智翠. 太平洋牡蠣品質的季節(jié)性變化及貯藏過程中的生化變化[D].青島: 中國海洋大學, 2006.

[11] 鄧樹勛, 王健. 高級運動生理學: 理論與應用[M]. 北京: 高等教育出版社, 2003: 4-5.

[12] 王友令, 張勝, 唐兆新. 氨基胍對內毒素血癥肉雞肝線粒體自由基代謝的影響[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2006, 36(2): 143-146.

[13] 戴捷, 梅啟明. 六氯苯對大鼠肝臟線粒體抗氧化物酶同工酶的影響[J]. 毒理學雜志, 2006, 20(6): 385-387.

[14] ZHAO Qin, XUE Changhu , LI Zhaojie , et al. Neuroprotective effects of gelatin hydrolysates from Stichopus japonicus on hydrogen peroxideinduced PC12 cell damage[C]//2009 International Conference of Natural Product and Traditional Medicine. Xi' an: Springer-Verlag, 2009: 393-397.

[15] WANG Jingfeng, WANG Yuming, TANG Qingjuan, et al. Antioxidant activities of low-molecular-weight gelatin hydrolysate derived from the sea cucumber Stichopus japonicus[J]. Journal of Ocean University of China, 2010, 9(1): 94-98.

[16] 鄭云郎. 谷胱苷肽的生物學功能[J]. 生物學通報, 1995, 30(5): 22-24.

[17] 曹桂霞, 李世昌, 白俊偉. 谷氨酰胺對機體免疫系統(tǒng)和運動能力的影響[J]. 中國臨床康復, 2006, 10(16): 150-151.

[18] MARTIN B, FRITZ B, MARTIN F, et al. The prolonged intake of L-arginine-L-aspartate reduces blood lactate accumulation and oxygen consumption during submaximal exercise[J]. Journal of Sports Science and Medicine, 2005(4): 314-322.

[19] MAXWELL A J, HO H V, LE C Q, et al. L-arginine enhances aerobic exercise capacity in association with augmented nitric oxide production[J]. Journal Applied Physiology, 2001, 90(3): 933-938.

[20] SCHAEFER A, PIQUARD F, GENY B, et al. L-arginine reduces exercise-induced increase in plasma lactate and ammonia[J]. International Journal of Sports Medicine, 2002, 23(6): 403-407.

[21] 徐運杰, 方熱軍. 支鏈氨基酸的抗疲勞作用[J]. 氨基酸和生物資源,2008, 30(1): 65-69.

[22] de PALO E F, GATTI R, CAPPELLIN E, et al. Plasma lactate, GH and GH-binding protein levels in exercise following BCAA supp- lementation in athletes[J]. Amino acids, 2001, 20(1): 1-11

[23] 黃金麗, 歐明毫. 支鏈氨基酸對賽艇運動員極限運動血葡萄糖異生的影響[J]. 天津體育學院學報, 2006, 21(4): 297-298.

Anti-fatigue Effect of Sea Cucumber Stichopus japonicus in Mice

LI Bing，WANG Jing-feng，FU Jia，LI Xiao-lin，LI Hui，ZHAO Qin，XUE Chang-hu*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

TS254.1

A

1002-6630(2010)15-0244-04

2009-12-22

國家“863”計劃項目(2007AA091805)；國家自然科學基金項目(30972284；30871944)

李冰(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為海洋生物活性物質。E-mail：lb435317714@163.com

*通信作者：薛長湖(1964—)，男，教授，博士，研究方向為水產品化學。E-mail：xuech@ouc.edu.cn