雌激素與山核桃油干預對去卵巢大鼠海馬早老基因-1與載脂蛋白E基因表達的影響

陳默然，張 巍，沈 楠，趙行宇

(1.吉林醫藥學院 科研處， 吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院生化教研室， 吉林 吉林 132013；3.吉林醫藥學院實驗中心， 吉林 吉林 132013；4.吉林醫藥學院心理教研室， 吉林 吉林 132013)

雌激素與山核桃油干預對去卵巢大鼠海馬早老基因-1與載脂蛋白E基因表達的影響

陳默然1，張 巍2，沈 楠3，趙行宇4,*

(1.吉林醫藥學院 科研處， 吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院生化教研室， 吉林 吉林 132013；3.吉林醫藥學院實驗中心， 吉林 吉林 132013；4.吉林醫藥學院心理教研室， 吉林 吉林 132013)

目的：觀察雌激素干預后，核桃油對去卵巢大鼠海馬組織早老基因-1(PS-1)與載脂蛋白E(aproE)基因表達及勻漿液中β淀粉樣肽(Aβ)含量的變化。探討核桃油對PS-1、aproE表達的調節與雌激素(E2)間的關系。方法：以去卵巢雌性大鼠為動物模型，實驗組灌胃給予核桃油100mg/(kg bw·d)(低劑量組)、200mg/(kg bw·d)(中劑量組)、400mg/(kg bw·d) (高劑量組) (n=16)。空白組給予相同劑量的生理鹽水。各組一半的大鼠隨機接受E2處理，采用RT-PCR檢測大鼠海馬PS-1與aproE基因表達，RIA檢測海馬Aβ的含量的變化，放免法測血清E2水平。結果：雌激素干預的模型鼠血清E2水平顯著高予未干預組(P＜0.01)；海馬Aβ含量空白組最高，隨核桃油劑量增加Aβ含量逐漸下降，中、高劑量組更顯著(P＜0.05)，E2干預后Aβ含量下降更明顯；空白組PS-1的表達最高而apoE的表達最低，隨核桃油劑量增加各劑量組PS-1的表達僅輕度下降，apoE-mRNA表達明顯增加；雌激素干預后PS-1的表達有所下降，apoE基因各組間表達差異消失。結論：E2和核桃油都可以通過降低去卵巢大鼠海馬的PS-1基因及增加aproE基因的表達來降低Aβ的水平；但二者對PS-1基因調節可能通過不同的途徑實現，而對apoE基因可能通過相同的途徑來調節。

RT-PCR；PS-1；apoE；Aβ；去卵巢大鼠

Abstract：Objective: To study the effect of pecan oil on the serum estrogen (E2) level and gene expressions of Alzheimer gene -1 (PS-1) and apolipoprotein E (aproE) gene and Aβ content in the hippocampus of ovariectomized rats subjected to E2 intervention.Methods: Ovariectomized female rats were used as animal model and divided into 8 groups for 8 rats in each group: groups given low dose (100 mg/kg) pecan oil alone or plus E2, separately named low-dose pecan oil group and low-dose pecan oil plus E2 group,middle-dose pecan oil group and middle-dose pecan oil plus E2 group and high-dose pecan oil group and high-dose pecan oil plus E2group obtained similarly, control group (given only saline) and E2 group (given only E2). RT-PCR was used to detect the gene expressions of PS-1 and aproE in rat hippocampus, and radioimmunoassay to detect the level of Aβ in rat hippocampal and serum E2 level. Results: E2 intervention resulted in a significant (P＜0.01) increase in serum E2 level in ovariectomized rats. The highest Aβ level was observed in the control group. Regardless of whether or not E2 intervention was adopted, Aβ level gradually decreased with increasing pecan oil dosage and a significant difference (P＜0.05) was observed within both middle and high dose groups. The presence of E2 resulted in a large decrease in Aβ level in comparison with the control group, which exhibited the highest PS-1 gene expression but the lowest aproE gene expression. For rats both with and without E2 intervention, PS-1 geneexpression showed only a slight decrease with increasing pecan oil dosage, while aproE gene expression markedly increased.However, at the same pecan oil dosages, E2 intervention resulted in a slight decrease in PS-1 gene expression but did not affect.The differences in aproE gene expression among these three pecan oil dosage groups disappeared. Conclusion: Both E2 and pecan oil PS-1 can attenuate PS-1 gene expression and elevate aproE gene expression so as to reduce Aβ level. Their regulatory effects on PS-1 gene might be achieved by different pathways; however, the same pathway seem to be used by them to regulate aproE gene.

Key words：RT-PCR；PS-1；apoE；Aβ ；ovariectomized rats

早老性癡呆(AD)的發生最終都可歸結于淀粉樣蛋白前體(APP)加工方式改變，從而導致β淀粉樣肽(Aβ)產生增加、沉積[1]，對神經細胞產生的毒性作用，這一過程的影響因素包括遺傳學改變、細胞老化、炎性反應、中毒反應及內分泌失調等。有多個遺傳基因參與這一過程的調節，Maheswaran等[2]的研究發現野生型早老基因-1(PS-1)轉基因鼠海馬區腦量減少，而PS-1可通過γ分泌酶活性調節Aβ的產生，說明PS-1與AD的關系密切。其他的研究則揭示載脂蛋白E(apoE)可與脂蛋白受體相互作用，具有輸送和調節脂類代謝的作用[3]，神經細胞apoE可與Aβ結合，形成apoE-Aβ復合物由中性粒細胞通過LRP介導清除[4]。我國傳統醫學認為山核桃具有健腦、抗衰老作用，可延緩AD的發生，然而這一作用的基因途徑并不清楚。近來的研究也表明，核桃油具有抗氧化[5-6]、降低膽固醇[7]，提高大鼠學習能力[8]的作用，這都為核桃油的抗衰老作用提供了證據。在AD病例中，女性是男性的2倍以上[9]，且在絕經后發病增加[10]，另外的研究也表明雌激素可減少Aβ水平[11-12]。說明AD的發生與雌激素的關系密切，研究發現雌激素不僅可使成年AKR 鼠腦皮質PS-1基因表達與蛋白表達下調[13]，減少Aβ的沉積，還可通過刺激α分泌酶的活性來調節APP代謝，減少Aβ的聚集[11]。山核桃的作用是否通過對PS-1、apoE的調節實現，以及其作用是否會受到體內雌激素水平的調節，目前并沒有明確的報道。本研究旨在觀察雌激素與野生山核桃油共同作用時對去卵巢大鼠海馬PS-1和apoE表達及內Aβ水平的影響，以探討其抗衰老作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

吉林野生核桃取其仁，烘干粉碎后，用石油醚在55℃水浴索氏提取6h，提取率為64.97%，油色淡黃，有香味；主要含有亞油酸63%、油酸18%、硬脂酸2%、棕櫚酸3.9%等脂肪酸及微量的VE。

血清雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒 北京市福瑞生物工程公司；苯甲酸雌二醇 天津金耀氨基酸有限公司；Aβ放射性免疫試劑盒 天津九鼎醫學生物工程有限公司；Trizol RNA分離試劑、逆轉錄試劑盒 Invitrogen公司。

γ放射免疫計數儀 安徽合肥科大創新有限股份公司；TC-512型PCR儀 英國Techne公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作與分組

去卵巢大鼠模型制作：Wistar成年雌性大鼠64只，10月齡，體質量(230±20)g，購于吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心。大鼠適應性1周后，腹腔注射1g/100mL戊巴比妥鈉(30mg/(kg bw·d))麻醉、固定，背部切口去雙側卵巢，分層縫合。去卵巢1周后，陰道涂片，已無性周期變化。

實驗分組：模型大鼠隨機分成8組(n=8)，對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、E2組、低劑量+E2組、中劑量+E2組、高劑量+E2組，前4組大鼠灌胃給與不同劑量核桃油：100mg/(kg bw·d)(低劑量組)、200mg/(kg bw·d)(中劑量組)、400mg/(kg bw·d)(高劑量組)，對照組灌胃給予生理鹽水，持續9周；后4組大鼠除接受與前4組對應的相同處理外，還接受雌激素處理，每只每3d腹腔注射苯甲酸雌二醇10μg；前4組與之對應，腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 E2與Aβ含量的測定

實驗結束時，大鼠摘眼球取血，4℃冰箱靜置過夜，低速臺式離心機3000r/min離心10min，小心吸取上清，按照試劑盒說明書操作步驟測E2的質量濃度，單位用pg/mL表示。大鼠斷頭取腦在冰臺上迅速剝離出海馬組織，分為兩份，一份稱質量、剪碎，加入10倍體積的冷生理鹽水，超聲勻漿， 4℃、3500r/min離心10min，取上清，按說明書測Aβ含量，用每mg勻漿蛋白中含pg表示(pg/mg pro)。另一份檢測PS-1、aproE表達。

1.2.3 RT-PCR檢測PS-1、aproE表達

取海馬組織各0.2g (每鼠取0.025g) 置5mL離心管中，加預冷的異硫氰酸胍變性溶液2mL，超聲勻漿。勻漿液采用Trizol RNA分離試劑提取RNA。取5μg總RNA，加入1μg的oligo(dT)l2-l8(0.5μg/μL)，按照Super-ScriptⅡ RT逆轉錄試劑盒產品說明書操作，合成cDNA第1鏈。PCR引物由primer5.0軟件設計， PS-1基因序列中1501～1701，片段長201bp，上游引物：5＇-ctcgccattttcaagaa agc-3＇，下游引物：3＇-gggcttgctctctgtttttg-5＇；apoE基因 856～1064，序列長209bp，上游引物：5＇-ggttcgagccaatagtggaa-3＇，下游引物：3＇-tattaagcaagggccaccag-5＇。各取2μL逆轉錄產物作為模板。反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30個循環后，于72℃延伸7min。并以β-actin為內參照，各取10μL反應產物，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果與分析

2.1 血清E2含量測定結果

各組血清E2水平見表1，雌激素處理前后的血清E2水平則差異顯著(P＜0.01)，雌激素處理組的E2水平明顯高于未處理組。

2.2 海馬勻漿液Aβ含量測定結果

海馬勻漿液Aβ含量見表2，對照組Aβ含量最高，E2干預后的含量明顯下降(P＜0.01)，隨著核桃油劑量的增加，海馬勻漿液Aβ含量不論是否經過E2處理均為下降趨勢，但E2處理后的Aβ含量各組無統計學差異。未經過E2處理的劑量下降更明顯，與對照組比較中劑量組P＜0.05、高劑量組P＜0.01，表現為明顯的劑量負相關。

2.3 PS-1與apoE的mRNA表達

在實驗條件下，PS-1與apoE的mRNA表達水平見圖1、3，對電泳圖的表達條帶進行分析，計算基因與β-actin吸收峰面積的比值，見圖2、4。每組2只樣本，重復4次。可以看出，未接受雌激素處理的大鼠PS-1的表達最多，apoE的表達最少，隨核桃油劑量的增加，PS-1的表達減少，apoE的表達增加，與對照組比較，中、高劑量組差異顯著(P＜0.01)；在經過雌激素處理后，較未處理的模型鼠PS-1的表達量雖有所下降，但趨勢與未經過雌激素處理組相似；aproE的表達上升，但組間差異減少。

圖1 RT-PCR檢測不同劑量組PS-1基因表達Fig.1 RT-PCR analysis of PS-1 gene expression in ovariectomized rats treated with pecan oil alone or combined with E2

圖2 不同劑量組海馬PS-1的表達水平比較(n=4)Fig.2 Effect of pecan oil alone or combined with E2on the relative expression ratio of PS-1 gene

圖3 RT-PCR檢測不同劑量組aproE基因表達Fig.3 RT-PCR analysis of aproE gene expression in ovariectomized rats treated with pecan oil alone or combined with E2

表1 各組大鼠血清E2水平(n=8)Table 1 Effect of pecan oil alone or combined with E2on E2levels in ovariectomized rats (n=8)

表2 各組大鼠海馬勻漿液Aβ含量(n=8)Table 2 Effect of pecan oil alone or combined with E2on Aβ levels in ovariectomized rats

圖4 不同劑量組組海馬aproE的表達水平比較(n=4)Fig.4 Effect of pecan oil alone or combined with E2on the relative expression ratio of aproE gene

3 討 論

Aβ與AD發生的關系密切，而 PS-1是γ分泌酶的激動劑，與β-分泌酶協同，剪切APP產生Aβ[14]，aproE則可以結合可溶性APP[15]，發揮清除Aβ的作用。目前大量的研究從Aβ產生與清除的角度來探索AD產生的機制。許多藥物都以自己的方式作用于這兩個環節，通過對Aβ產生及清除的干預來影響AD的產生和發展。

在本實驗中觀察到E2可明顯的降低海馬組織中Aβ的含量，這與以前的研究[4]一致。在低E2水平，核桃油具有明顯的降低去卵巢大鼠海馬組織中Aβ含量的作用，量效關系明顯；而在高E2水平，作用進一步增強，說明E2與山核桃之間有協同作用。這提示核桃油的攝入可以明顯降低Aβ水平，起到抗衰老的作用；婦女在更年期后體內雌激素水平明顯下降，如果攝入適量的核桃油可降低腦內Aβ含量，具有預防AD的作用。

實驗還顯示，山核桃油具有減少PS-1表達、增加apoE表達的作用。E2干預使PS-1表達進一步減少，作用相加，可以減少Aβ的生成。apoE的表達在E2干預后增加，而組間差異不明顯的結果表明，E2的存在可掩蓋山核桃油的作用，而apoE的表達總量不發生改變，二者具有明顯的交互作用。可以推測，山核桃油與E2在對PS-1的調節上，具有相對獨立性的途徑，而對apoE的調節可能通過相同的環節進行調節。

以前的研究[16-17]中發現，E2的降Aβ的作用可以通過增加神經生長因子的表達，激活α分泌酶的活性，使可溶性APP剪切產物增加，以及增加apoE的表達及調節膽堿合成等途徑實現。而山核桃油以何種形式進行調節，其機制需進一步研究。總之山核桃油可通過下調PS-1、上調apoE表達來減少Aβ生成與提高Aβ的清除，達到保護神經細胞的作用。特別是對絕經期婦女預防早老癡呆的發生具有積極意義。

[1] HARDY J, SELKOE D J. The amyloid hypothesis of Alzheimer 's disease: progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science,2002, 297: 353-356.

[2] MAHESWARAN S, BARJAT H, RUECKERT D, et al. Longitudinal regional brain volume changes quantified in normal aging and Alzheimer 's APP x PS1 mice using MRI[J]. Brain Res, 2009, 1270: 19-32.

[3] NOGUCHI S, MURAKAMI K, YAMADA N. Apolipoprotein E gene type and Alzheimer 's disease[J]. Lancet, 1993, 342: 737.

[4] FRATIGLIONI L, VIITANEN M, von STRAUSS E, et al. Very old women at highest risk of dementia and Alzheimer's disease: incidence data from the Kungsholmen Project, Stockholm[J]. Neurology, 1997,48: 132-138.

[5] 張清安, 李建科, 李澤珍. 核桃油對小鼠肝臟與腦組織的抗氧化作用[J]. 營養學報, 2004, 26(5): 408-409.

[6] 范學輝, 李建科, 張清安, 等. 核桃油對小鼠體內抗氧化酶活性及總抗氧化能力的影響[J]. 西北農林大學學報, 2004, 32(11): 122-124.

[7] 李建科, 張清安, 沈杰, 等. 核桃油對小鼠血脂及膽固醇的影響[J].食品與生物技術學報, 2005, 24(5): 77-79.

[8] 陳丹, 趙聲蘭. 核桃油保健及藥用功效研究[J]. 亞太傳統醫藥, 2009,5(1): 27-29.

[9] MCGONIGAL G, THOMAS B, McQUADE C, et al. Epidemiology of Alzheimer 's presenile dementia in Scotland 1974-88[J]. Br Med, 1993,306(6879): 680-683.

[10] VILLARROYA-PASTOR M T. Profile of Alzheimer s disease in women[J]. Rev Neurol, 2001, 32(12): 1178-1781.

[11] XU H, GOURAS G K, GREENFIELD J P, et al. Estrogen reduces neuronal generation of Alzheimer beta-amyloid peptides[J]. Nat Med,1998, 4(4): 447-451.

[12] GREENFIELD J P, LEUNG L W, CAI D. et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis[J]. Bio Chem, 2002, 277: 2128-2136.

[13] GHOSH S, THAKUR M K. PS1 expression is downregulated by gonadal steroids in adult mouse brain[J]. Neurochem Res, 2008, 33(3):365-369.

[14] LAM BERT J C, WAVRANT-DeVRIEZE F, AMOUYEL P, et al.Association at LRP gene locus with sporadic late-onset Alzheimer' s disease[J]. Lancet, 1998, 351(9118): 1787-1788.

[15] YAFFE K, HAAN M, BUERS A, et al. Estrogen use, apoE, and cognitive decline: evidence of gene-environment interaction[J]. Neurology,2000, 54: 1949-1954.

[16] 蔣波, 廖二元, 譚利明, 等. 長期口服雌激素或復方雌激素對去卵巢大鼠海馬結構內β-淀粉樣蛋白沉積的影響[J]. 臨床神經病學雜志,2006, 19(1): 42-45.

[17] 蔣波, 廖二元, 譚利明, 等. 長期口服雌激素對去卵巢大鼠海馬結構內β-淀粉樣前體蛋白及其mRNA表達的影響[J]. 中國老年雜志,2006, 26(11): 1491-1494.

Intervention Effect of Estrogen Combined with Pecan Oil on the Gene Expressions of Alzheimer gene -1 and Apolipoprotein E Gene in Ovariectomized Rat Hippocampus

CHEN Mo-ran1，ZHANG Wei2，SHEN Nan3，ZHAO Xing-yu4,*
(1. Research Division, Jilin Medical College, Jilin 132013, China；2. Department of Biochemistry, Jilin Medical College,Jilin 132013, China；3. Center of Experiment, Jilin Medical College, Jilin 132013, China；4. Department of Psychology,Jilin Medical College, Jilin 132013, China)

TS255.1

A

1002-6630(2010)15-0264-04

2009-12-02

陳默然(1977—)，男，講師，碩士， 研究方向為生理學。E-mail：jlmmczxy@163.com

*通信作者：趙行宇(1970—)，男，副教授，碩士，研究方向為心理學。E-mail：jlmpcxlx@163.com