耐力訓練對高脂膳食大鼠骨骼肌線粒體脂肪氧化及PGC-1α基因表達的影響

張 媛，漆正堂，郭 維，丁樹哲

耐力訓練對高脂膳食大鼠骨骼肌線粒體脂肪氧化及PGC-1α基因表達的影響

張 媛，漆正堂，郭 維，丁樹哲

目的：研究耐力訓練對高脂膳食大鼠骨骼肌線粒體脂肪氧化相關酶活性及基因表達的影響。方法：40只SD大鼠，隨機分成普通膳食對照組（C）與耐力訓練組（E）；高脂膳食對照組（H）與耐力訓練組（R），每組10只。兩耐力訓練組大鼠進行8周跑臺訓練。結果：耐力訓練使高脂膳食大鼠體重（P=0.000）、IR 指數（P=0.021）顯著降低并維持在正常水平，使骨骼肌線粒體 β-HAD（P=0.011）、CS活性（P=0.047）、CPT-1β mRNA（P=0.037）及PGC-1α蛋白表達水平（P=0.007）顯著增高。結論：耐力訓練通過適度調節參與線粒體脂肪氧化關鍵酶β-HAD、CS活性及CPT-1β、PGC-1α基因表達，優化高脂膳食機體在線粒體水平的脂肪氧化能力。

線粒體脂肪氧化；高脂膳食；耐力訓練；胰島素抵抗；肉堿酰基轉移酶；過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1

1 研究背景

高脂膳食與缺乏運動導致機體對自身胰島素敏感性降低，引發相關代謝綜合征[1-2]。耐力訓練時脂肪為主要供能物質，可有效緩解高脂膳食給機體帶來的高脂負荷，同時提高線粒體功能，增強線粒體脂肪氧化能力[3]。運動中限制LCFA被利用的問題仍未被解決，脂肪在線粒體水平的氧化代謝顯得尤為重要[4]。當脂肪供給與氧化代謝不平衡時，脂肪代謝異常很可能導致骨骼肌發生IR現象，而后者又與線粒體脂肪氧化關系密切。此外，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1（PGC-1）參與調節適應性產熱、肝糖異生、脂肪酸β氧化等代謝過程[5]，在長期耐力訓練誘導骨骼肌適應方面起到關鍵作用。因此，本實驗重點關注與線粒體脂肪氧化關系密切的相關酶及基因，比較高脂膳食單因素干預的大鼠與高脂膳食伴隨耐力訓練的大鼠在線粒體水平脂肪氧化過程中所發生的不同應激變化，進一步探討耐力訓練對高脂膳食機體線粒體水平脂肪代謝的作用機制，為耐力訓練可能部分通過優化線粒體脂肪氧化從而調節機體胰島素抵抗水平的設想提供理論依據。

2 研究方法

2.1 動物及飼養

清潔級SD雄性大鼠40只（上海斯萊克實驗動物有限公司提供），體重（120±5）g。分籠飼養，每籠4只，自由飲食。室溫20～23℃，相對濕度50%～70%，自然光照。高脂飼料成分：水分8.6%，粗脂肪16.2%，粗蛋白含量18.8%，粗灰分5.2%，粗纖維3.98%，無氮浸出物45.2%。

2.2 動物分組及運動方案

SD大鼠適應性飼養6天后，隨機分為普通膳食對照組（C）與耐力訓練組（E）；高脂膳食對照組（H）與耐力訓練組（R），每組10只。耐力訓練組大鼠進行8周跑臺訓練，每周6天，每天一次，周日停訓，每次訓練40～60 min，速度為0.8 km/h～1.2 km/h。

作者單位：華東師范大學體育與健康學院，上海200241。

2.3 動物取材

最后一次訓練結束24～48 h內，大鼠斷頸椎處死，處死前禁食6 h。心臟取血，離心后，抽取上層血漿4℃保存。取下肢腓腸肌，液氮速凍后，-80℃保存，待檢測。

2.4 測試指標與方法

2.4.1 血液指標及酶活性檢測 空腹血糖、血漿胰島素濃度分別采用比色法和酶聯免疫（ELISA）測定，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。線粒體檸檬酸合成酶（CS）、羥脂酰CoA脫氫酶（β-HAD）活性檢測均采用美國GENMED科技公司試劑盒，蛋白定量采用考馬斯亮藍法。Tecan Infinite M200酶標儀檢測吸光度。

2.4.2 實時熒光定量PCR檢測CPT-1β、PGC-1α的基因轉錄 提取大鼠腓腸肌組織總RNA，逆轉錄體系中約含RNA0.1～5 μg，逆轉錄后得cDNA模板。PCR總反應體系20 uL，包括cDNA 模板 4 uL、預混液 16 uL（2×SYBR green PCR MasterMix 10 uL，前后引物各1 uL，RNase free水 4 uL）。CPT-1β上游引物：5'-ATCTCGGTTCCAGTTCTACT--TCC-3'； 下 游 引 物 ：5'-ACGACAGTCTCACTTAGAGGCAC-3'，PGC-1α 上游引 物：5'-TGCAG--GCCTAACTCCTCCCAC-3'； 下 游 引 物 ：5'-AATAGGCCATCCATGGCTAGTCC-3'，β-actin 上游引物：5'-CCTCTATGCCAACACAG--TGC-3'； 下 游 引 物 ：5'-ATACTCCTGCTTGCTGATC--C-3'。PCR溫度循環參數：Step 1：預變性[95 ℃，60 s]；Step 2：[95 ℃，15 s；61 ℃，30 s；72 ℃，45 s，收集熒光]×40個循環；Step 3：建立熔解曲線，再變性[95℃，75 s]，退火[55℃，60 s]，然后從55℃緩慢加熱到95℃，15 s；每1℃收集熒光。反應結束后，按照各反應孔Ct值，以β-actin基因為內參，根據公式2-ΔCt計算各樣品目的基因相對表達量。

2.4.3 骨骼肌線粒體、細胞核提取 取（50～100）mg腓腸肌組織：1）加入1 mL線粒體勻漿介質，電動勻漿后1 300 g 4℃離心10 min，將上清液17 000 g 4℃離心15 min，保留沉淀，加入1mL勻漿介質，重懸，17 000 g 4℃離心15 min，棄上清保留沉淀（線粒體），加入0.5 mL勻漿介質，重懸，保存待測。2）加入1 mL細胞核裂解液，電動勻漿后1 000 g 4℃離心10 min，棄上清，加入1 mL濃蔗糖溶液，吹打重懸（細胞核粗提物），重懸液23 000 g 4℃離心30 min，棄上清，加入0.3 mL細胞核裂解液和0.3 mL甘油，吹打重懸，-80℃保存。

2.4.4 Western Blotting測定線粒體CPT-1β、細胞核PGC-1α的蛋白表達量 分別提取線粒體、細胞核蛋白作為待測樣品，采用BCA蛋白定量方法測定各樣品總蛋白濃度，-80℃保存待檢測。取100 L樣品加入5×SDS上樣buffer，每上樣孔加樣30 L。配膠放入100 mL陰極buffer，平衡15 min，用甲醇（100%）和雙蒸水浸泡后取出用陽極bufferII平衡10 min后轉膜1 h，將膜與膠及濾紙剝離，用麗春紅溶液檢測轉膜效率。一抗（山羊抗PGC-1α 單克隆抗體、GAPDH，Santa Cruz公司生產）、二抗（HRP標記兔抗山羊二抗，Santa Cruz公司生產）中孵育后DBA溶液顯色，水洗膜終止反應。TANON GIS-2008凝膠成像儀拍照并用天能GIS凝膠圖像處理系統進行數據分析，每個泳道得到遷移率、強度、凈面積、平均密度4個數據。以待測蛋白與內參蛋白的平均密度之比作為待測蛋白的相對表達水平。

2.5 統計學分析

SPSS15.0軟件分析處理數據，采用雙因素方差分析檢驗不同影響因素（膳食、運動）對變量的影響，并用Tukey法檢驗組間差異顯著性。檢測結果以均數±標準差（±S）表示，以P＜0.05表示在統計學上有顯著性差異，以P＜0.01表示在統計學上有極顯著性差異。

3 研究結果

3.1 耐力訓練對高脂膳食大鼠體重的影響

各組大鼠體重較實驗前均有所增長。高脂膳食對大鼠體重有顯著影響，H組比C組顯著增高（F=4.728，P=0.036）。此外，R組與H組相比，大鼠體重顯著降低，具有極顯著性差異（P=0.000）（見圖 1）。

圖1 大鼠體重變化曲線Fig 1 Rats'Weight（g）of Different Groups

3.2 耐力訓練對高脂膳食大鼠IRI的影響

與C組相比，高脂膳食（F=7.163，P=0.015）、耐力訓練（F=9.904，P=0.005）對大鼠IRI均有顯著影響。此外，R組與H組相比，大鼠IRI顯著降低，具有極顯著性差異（P=0.021）（見表1）。

表1 大鼠胰島素抵抗指數Table 1 IR Index of Rats

3.3 耐力訓練對高脂膳食大鼠骨骼肌β-HAD、CS活性的影響

與C組相比，高脂膳食、耐力訓練單因素以及膳食與運動交互作用對大鼠骨骼肌β-HAD、CS活性均具有顯著影響，其中H組β-HAD活性顯著增高，CS活性顯著降低，E組β-HAD、CS活性均顯著增高。此外，R組與H組相比，β-HAD活性顯著增高（P=0.001）（見表 2）。

表2 骨骼肌線粒體β-HAD、CS活性Table 2 The Activity of Skeletal Muscle Mitochondrial β-HAD、CS

3.4 耐力訓練對高脂膳食大鼠骨骼肌CPT-1β、PGC-1α基因表達的影響

與C組相比，高脂膳食對大鼠CPT-1β mRNA（F=47.759，P=0.000）及蛋白（F=11.456，P=0.002）表達影響顯著；耐力訓練使大鼠CPT-1β mRNA表達顯著增高（F=11.204，P=0.002）。此外，R組與H組相比，CPT-1β mRNA表達顯著增高（P=0.037）（見圖2）。與C組相比，高脂膳食使大鼠PGC-1α蛋白表達顯著增高（F=43.283，P=0.000）；耐力訓練使大鼠 PGC-1α mRNA 表達顯著降低（F=21.796，P=0.000）；膳食與運動交互作用對大鼠PGC-1α蛋白表達影響顯著（F=20.832，P=0.000）。此外，R組與H組相比，PGC-1α mRNA表達顯著降低（P=0.003）而其蛋白表達顯著增高（P=0.007）（見圖 3）。

圖2 CPT-1β mRNA、蛋白表達（n＝6）Fig 2 CPT-1β mRNA and Protein Expression

圖3 PGC-1α mRNA、蛋白表達（n＝6）Fig 3 PGC-1α mRNA and Protein Expression

4 討論與分析

4.1 耐力訓練對高脂膳食大鼠體重的影響

耐力訓練對普通膳食大鼠體重無顯著影響，而使高脂膳食大鼠體重增長幅度明顯降低，從而使大鼠在高脂膳食作用下，體重仍能夠保持與普通膳食大鼠相同的增長幅度。由此說明，高脂膳食伴隨耐力訓練可以有效地抑制高脂膳食單因素下的體重增長。耐力訓練主要依靠脂肪氧化供能，高脂膳食下機體攝入脂肪過多，耐力訓練的優勢得以充分體現。提示我們，高脂膳食的個體可通過耐力訓練的運動方式限制體重增長，而普通膳食個體也可通過耐力訓練維持正常體重。

4.2 耐力訓練對高脂膳食IR指數的影響

IR是指機體對一定量胰島素的生物學反應低于正常水平的一種現象，即對胰島素不敏感。IR指數是衡量機體胰島素抵抗程度的指標之一，造成IR的原因十分復雜。一種觀點認為，高脂膳食機體骨骼肌中脂肪代謝中間產物含量過多是導致IR的原因之一[7]。研究發現，受試者連續高脂膳食4周后，骨骼肌中IMTG含量將增高50%，降低食物中脂肪含量，僅3周IMTG含量將明顯下降[8]。由此推測，高脂膳食會增加機體脂代謝負荷，致使脂肪代謝中間產物在體內堆積，不能夠及時被完全氧化，易造成胰島素信號系統異常，導致IRI升高。而耐力訓練可緩解由高脂膳食引起的IRI過高現象，并且使機體IRI維持在正常水平。目前研究認為，運動可以通過改善胰島素受體處和胰島素受體后抵抗來增加胰島素的敏感性，進而預防與IR相關的糖脂代謝紊亂，2-型糖尿病、高血壓等疾病的發生[9]。Lorraine指出，有氧運動可降低骨骼肌脂肪含量，加速骨骼肌中脂肪酸氧化及增加肌肉對葡萄糖的攝取能力，從而對控制血糖含量具有重要作用[10]。

4.3 耐力訓練對高脂膳食大鼠骨骼肌線粒體β-HAD、CS活性的影響

β-HAD與CS分別是反映線粒體β氧化、三羧酸循環水平的關鍵調節酶。有研究表明，人體在進行6天高脂膳食[11]或4周適當高脂膳食（脂肪含量占總能量的53%）[12]后骨骼肌β-HAD活性與普通膳食均無差異。本研究發現，8周高脂膳食提高大鼠β-HAD活性但卻使CS活性明顯降低。由此推測，高脂膳食提高線粒體β氧化水平，卻降低線粒體TCA循環水平，使脂肪β氧化終產物乙酰輔酶A不能及時進入TCA循環進行氧化代謝，從而造成這些脂肪代謝中間產物在線粒體內堆積，加重高脂負荷，影響線粒體功能及脂肪氧化水平。此外，耐力訓練使高脂膳食大鼠骨骼肌β-HAD、CS活性顯著增高，說明耐力訓練可通過脂肪消耗供能，進一步提高線粒體β氧化，同時積極改善線粒體功能，提高TCA循環水平以緩解高脂膳食對線粒體脂肪氧化的負面影響。2007年Muoio假設，線粒體β氧化與TCA循環之間存在的“disconnect”是誘發產生IR現象的一個主要原因[13]。2009年Gaster發現，肥胖型糖尿病肌管的線粒體β氧化與TCA循環之間存在“mismatch”[14]。因此，進一步研究這種“disconnect”或“mismatch”及運動對其的作用是深入認識誘發IR機制及預防、治療與IR相關代謝綜合征的新途徑。

4.4 耐力訓練對高脂膳食大鼠骨骼肌CPT-1β、PGC-1α基因表達的影響

高脂膳食使大鼠CPT-1β基因在轉錄水平代償性增高，卻顯著抑制CPT-1β蛋白表達水平。若過多LCFA不能及時進入線粒體進行氧化，勢必會造成細胞內脂肪代謝中間產物堆積，進而影響機體正常脂肪代謝。此外，運動可通過激活PPARα有效促進機體對脂肪酸的利用，從而提高CPT-1表達量[15]。耐力訓練通過對骨骼肌CPT-1β基因的調控，使機體即使處于高脂膳食狀態，也會加速脂肪代謝，緩解體內脂肪異位沉淀。有趣的是，耐力訓練同樣并沒有使高脂膳食大鼠CPT-1β蛋白表達呈一致上調。這種同一基因在轉錄水平上調但在翻譯水平未出現一致性上調的現象時有發生，可能由于基因在轉錄與翻譯之間需要諸多環節，任何一個環節都可能決定基因最終的蛋白表達水平。總之，運動對CPT-1調節的復雜性顯而易見，對骨骼肌CPT-1β基因轉錄水平以及翻譯后蛋白表達水平的調節存在許多變數。運動訓練時機體對脂肪酸供給的需求狀況決定了線粒體脂肪酸的氧化程度，并非只要進行耐力訓練就一定會使機體脂肪代謝相關基因表達上調，其最終變化方向主要取決于機體需求。此外膳食結構也是影響運動對CPT-1調節的一個重要因素。

高脂膳食雖然使大鼠PGC-1α蛋白表達顯著上調，卻降低線粒體CS活性并伴隨IRI增高。提示：高脂膳食誘導PGC-1α蛋白表達上調會對機體產生不利影響。有研究表明，PGC-1α超出正常水平過度上調或下調，都將對機體產生負面影響[16]。此外，高脂膳食大鼠伴隨耐力訓練時骨骼肌PGC-1α在轉錄水平顯著下調，而在轉錄后翻譯水平卻顯著上調，并與高脂膳食單因素作用于大鼠的效果截然不同，說明耐力訓練可能使骨骼肌PGC-1α基因轉錄—翻譯過程高效化，使機體向良性代謝狀態轉變。值得注意的是，耐力訓練使普通、高脂膳食大鼠PGC-1α mRNA表達均顯著降低，這與以往研究結果不同，或許因為運動誘導PGC-1α基因表達具有很強的時相性。運動后PGC-1α基因表達顯著增高，運動后2 h時達到峰值，2 h后呈現下降趨勢，24 h時基本與運動前水平一致[17]。另外，耐力訓練對普通膳食大鼠PGC-1α蛋白表達水平的調控趨于穩定，而對高脂膳食大鼠的調控較為顯著。

5 結 論

耐力訓練可有效控制高脂膳食大鼠體重增長速度并有利于其IRI維持在正常水平。耐力訓練通過適度調節參與線粒體脂肪氧化過程β-HAD、CS關鍵酶活性及CPT-1β、PGC-1α基因表達，優化機體在線粒體水平的脂肪氧化能力，從而使高負荷線粒體脂肪氧化狀態得以緩解，為高脂膳食機體在線粒體水平維持正常的脂肪氧化提供保障。

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Effects of Endurance Training on Mitochondrial Lipid Oxidation and PGC-1α Gene Expression of High-Fat Diet Rats'Skeletal Muscle

ZHANG Yuan，QI Zhengtang，GUO Wei，DING Shu-zhe
（School of PE&Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China）

Purpose：Investigate the effects of 8-week endurance training on mitochondrial lipid oxidation-related enzymes and genes expression in high-fat diet rats.Methods：40 male SD rats were randomly assigned to standard diet control group （C）and endurance training group （E），high-fat diet control group （H）and endurance training group （R），ten in each group.The two endurance training groups'rats were accustomed to 8-week treadmill training.Results：Endurance training efficiently decreased the weight（P=0.000）and IR index（P=0.021）in the high-fat diet rats as well as significantly increased the activity of β-HAD（P=0.011），CS（P=0.047）and the expression of CPT-1β mRNA（P=0.037）and PGC-1α protein（P=0.007）in high-fat diet rats'skeletal muscle mitochondrial.Conclusion：Endurance training optimizes the whole process of fat oxidation at the mitochondrial level through moderate regulating the activity of β-HAD and CS enzymes and the expression of CPT-1β and PGC-1α，which are involved in mitochondrial fat oxidation.

mitochondrial fat oxidation；high-fat diet；endurance training；mitochondrial lipid oxidation；insulin resistance（IR）；CPT-1β；PGC-1α

G 804.2

A

1005-0000（2010）03-0193-04

2010-02-08；

2010-04-08；錄用日期：2010-04-13

國家自然科學基金項目（項目編號：30871212）；教育部新世紀優秀人才支持計劃（項目編號：790013p8）

張 媛（1984-），女，陜西寶雞人，華東師范大學在讀博士研究生。