清肺消炎丸對COPD急性發作期大鼠作用機制的研究

劉 偉 孫增濤 劉恩順 付 敏 關 鵬 蘇景深天津中醫藥大學第二附屬醫院（300161）

清肺消炎丸對COPD急性發作期大鼠作用機制的研究

劉 偉 孫增濤 劉恩順 付 敏 關 鵬 蘇景深
天津中醫藥大學第二附屬醫院（300161）

消肺消炎丸；COPD；實驗研究

COPD是以慢性炎癥以及炎癥性損傷和修復造成氣道和血管壁重塑為基本病理特征，進而引起慢性氣流受限或受阻的一類疾病。CO P D目前居全球死亡原因的第4位。[1]我國40歲以上人群COPD的總患病率達8.2%，其中男性的患病率是1 2.4%，女性是5.1%，COPD在農村的患病率是8.8%，在城市是7.8%[2]。清肺消炎丸是在醫圣張仲景《傷寒論》“麻杏石甘湯”基礎上化裁，組成的中藥復方制劑，經多年臨床觀察，該藥清肺化痰、止咳平喘功效獨特，臨床應用療效顯著，可以滿足COPD急性發作期臨床治療需要并得到臨床試驗的驗證。本研究從COPD大鼠肺組織病理、氣道和肺部炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡等指標的變化，探討清肺消炎丸治療COPD急性發作期的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性清潔級Wistar大鼠40只，月齡8～10周，平均體重250g～300g，由天津中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2 藥物 清肺消炎丸，由天津達仁堂制藥有限責任公司提供；氨茶堿片，天津力生制藥股份有限公司，批號：0801002，規格0.1g/片，研碎溶于生理鹽水制成懸濁液。

1.1.3 試劑 大鼠ELISA 法GSH試劑盒、SOD試劑盒（美國Adlitteram diagnosticlaboratories lnc公司生產）；MMP-9及山羊二步法檢測試劑盒(pv6003)試劑盒：購于北京中杉生物技術有限公司。MMP-2試劑盒、TIMP-1試劑盒、Ln試劑盒、TNF-α試劑盒、TGF-β1試劑盒：購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.4 儀器與設備 OLYMPUS CX—31顯微鏡為日本OLYMPUS光學儀器有限公司生產。JVC數碼相機為日本JVC公司生產。HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統由武漢千屏影像技術有限責任公司生產。自制煙霧染毒箱（長寬高：60cm×39cm×40cm）；

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 按照隨機數字表法分為四組，每組10只。空白對照組(A組)，COPD模型組(B組)，氨茶堿組(C組)，清肺消炎丸組（D組）。采用煙熏及內窺鏡下氣管滴入內毒素造模法制造 COPD 大鼠模型[1]。除正常對照組呼吸正常空氣外，其它各組大鼠每天上午在自制的密閉箱內熏大前門牌香煙霧0.5h。在實驗開始第 1 天和第 14 天時，各組大鼠均用乙醚麻醉，除正常對照組在硬式鼻腔鏡引導下經聲門緩慢滴入200μl 生理鹽水外，其它各組大鼠均經上方式氣道內緩慢注入200μl 內毒素水溶液(1mg/ml)，當日不予被動吸煙。連續熏煙四周后，造成慢性阻塞性肺疾病模型。

1.2.2 給藥方法:造模成功后，各組分別給藥干預 動物給藥劑量參照動物與人體的每公斤體重劑量折算系數表。清肺消炎丸組藥物用量為：1.56g/ kg；氨茶堿組藥物用量為：31.25mg/kg；模型組和對照組分別灌服 0.9%生理鹽水；各實驗組給藥體積均為 1ml/100g 體重，每天給藥一次，連續給藥 7天。

1.2.3 觀察指標及方法 各組大鼠在最后一次灌藥后，隔天取材，以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉麻醉大鼠，腹主動脈取血5ml，離心取上清液，采用雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定大鼠血清中SOD、GSH，免疫組化方法M檢測MP-2，MMP-9，TIMP-1，LN，TGF-β。統一切取各組大鼠右肺并浸泡于中性福爾馬林液固定保存，固定48h 后，取固定好的右肺組織常規脫水、透明、浸臘、包埋，切成5μm 厚的切片，行蘇木精-伊紅(HE) 染色，觀察一般病理情況，

1.2.4 統計學方法 實驗數據采用SPSS11.5統計軟件分析，所有結果均以表示。各計量數據先進行正態檢驗和方差齊性檢驗，凡符合正態分布和方差齊性的數據，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，多組間兩兩比較采用LSD法。對等級數據和不符合正態分布或方差齊性的計量數據，則進行秩和檢驗(Kruskal-Wallis法)，多組間兩兩比較采用Mann-Whitney U法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 正常組大鼠體肥，反映敏捷，好活動，皮毛有光澤。造模各組大鼠神情倦怠，喜蜷縮，皮毛無光澤且活動能力下降。造模各組大鼠于第三天的時候開始有咳嗽，口鼻潮濕等。在造模過程中，大鼠出現咳嗽，呼吸困難、喉間哮鳴音，喜靜少動，強刺激活動后可見上述喘咳癥狀加重。喂藥后，清肺消炎丸組可見氣喘、咳嗽減輕，以及口鼻分泌物減少。氨茶堿組亦可見喘咳癥狀減輕。

2.2 肺組織病理學觀察 正常對照組（圖4）呼吸道及肺泡結構正常，支氣管纖毛排列整齊，肺泡結構完整，無氣腫及少許炎癥。COPD 模型組（圖1）可見肺泡腔明顯擴大、間隔變窄、肺泡壁斷裂、擴張的肺泡融合成較大的囊腔，呈明顯的肺氣腫改變；血管腔充血，肺間質及氣道管壁炎性細胞浸潤；肺間質及血管旁均可見大量吞噬了煙塵顆粒的AM，部分AM崩解破壞；成纖維細胞明顯增加，可見小氣道平滑肌增殖、管腔狹窄以及血管壁增厚等結構重塑。氨茶堿組（圖3）仍見有大量炎癥細胞的浸潤；清肺消炎丸組（圖4）用藥后可見明肺部炎癥較模型組有明顯的改善。

圖1

圖2

圖3

圖4

2.3 大鼠肺組織腫瘤壞死因子α（TNF-α） 見附表1

表1 大鼠肺組織TNF-α陽性細胞的平均吸光度值

2.4 大鼠肺組織基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的檢測結果 見附表2

表2 大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1陽性細胞的平均吸光度值

2.6 大鼠肺組織基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和粘連蛋白（LN）蛋白的檢測結果 見表3。表3 大鼠肺組織MMP-2和LN陽性細胞的平均吸光度值

注：與空白組比* P＜0.05；與模型組比，△P＜0.05；

3 討論

COPD 是一種以中性粒細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞(尤其是CD+8 T淋巴細胞) 在肺不同部位增加為特征的慢性炎癥性疾病。激活的炎癥細胞釋放多種遞質，包括TNF –α、IL – 8、白三烯B4 (LTB4 )等。這種異常的炎癥反應是COPD重要病理過程如細支氣管炎、肺氣腫的危險因素。炎前因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 在COPD 氣道慢性炎癥的發生和發展中的重要地位已獲得公認。它能誘導炎癥反應，增加氣道中性粒細胞數目，促進中性粒細胞粘附而加強異常細胞外彈性蛋白溶解活性，在COPD發生發展中起重要作用。

COPD 大鼠肺組織中TNF-α水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)，提示該細胞因子與COPD 氣道炎癥及其病理改變密切相關。清肺消炎丸可降低肺組織中TNF-α水平，表明該藥具有一定的抑制COPD 氣道及肺部炎癥的作用。可以認為清肺消炎丸通過減少肺組織中TNF-α水平，進而減輕炎癥細胞的浸潤，是治療該病的有效途徑之一。

MMP-9和TIMP-1 的動態平衡，目前被認為是反映氣道組織破壞與修復動態平衡的標志。MMP-9即明膠酶B，其主要作用為降解彈力纖維、明膠、及Ⅳ、V型膠原。其參與COPD的發病機制主要是通過破壞肺泡基質成分，使肺泡結構破壞，形成肺氣腫及參與氣道重塑而導致氣流阻塞。MMP-2即明膠酶A主要降解彈力纖維、纖維連接素及I、Ⅳ、V、Ⅶ 型膠原等，MMP-2的增多使氣道結構細胞失去正常的支撐作用。LN是基底膜透明層特異的結合蛋白，是細胞外基質（ECM）的主要組成部分之一，其作用是固定上皮、內皮和肌肉并支持其生長。LN 顯著增高，表明有過多的LN生成并沉積于肺組織，同時釋放入血和支氣管上皮襯液，參與上皮和內皮細胞的修復和過度增生。細胞外基質破壞和修復常常維持平衡，一旦平衡打破即出現病理狀態。

本實驗本研究結果表明，COPD 大鼠模型肺組織中MMP-9、MMP-2、TIMP-1及LN的水平明顯高于正常對照組(陽性細胞平均值P＜0.05)，提示蛋白酶/抗蛋白酶系統及細胞外基質參與了COPD病理改變。

清肺消炎丸組可降低肺組織中MMP-9、MMP-2、TIMP-1及LN水平，改善MMP-9/TIMP-1比例失衡，表明該藥具有調節蛋白酶/抗蛋白酶，抑制細胞外基質過度沉積，改善氣道重塑的作用。

[1] 中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.COPD診治指南(2007年修訂版)[S].繼續醫學教育,2007,21(2):31-42.

[2] ZHONG N，WANG C，RAN P，et a1.Prevalence ofchronic obstructive pulmonary disease in China：a large，population— based survey[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176:753-760

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.122

1672-2779（2010）-18-0159-02

2010-07-30）