兔不完全性截癱損傷脊髓血管內皮生長因子（VEGF）免疫組化陽性表達的動態變化※

劉 潔 劉 盟 王 群湖南中醫藥大學第一中醫臨床學院（4008） 中南大學00屆外語畢業生（400）

兔不完全性截癱損傷脊髓血管內皮生長因子（VEGF）免疫組化陽性表達的動態變化※

劉 潔1劉 盟2王 群1
1湖南中醫藥大學第一中醫臨床學院（410208） 2中南大學2010屆外語畢業生（410012）

目的 探討兔不完全性截癱后損傷脊髓血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF）免疫組化陽性表達的動態變化，探討其在脊髓損傷過程中的作用。方法 采用壓迫法造成不完全截癱模型，傷后6h、7d、15d、取損傷脊髓組織3mm，用免疫組織化學S-P法染色，并用彩色圖象分析系統進行圖像分析。結果 脊髓損傷VEGF表達變化分為兩個階段：第一階段表達為最高峰值傷后6小時。第二階段表達峰值為傷后15d。結論 VEGF可為脊髓損傷的時間提供診斷依據: 傷后6h為脊髓損傷的最高峰期主要是脊髓出血，炎細胞浸潤，脊髓水腫時期，VEGF可為脊髓損傷提供治療依據：15d時，VEGF增加血管通透性，改善血液循環，增加生殖與遷移，主要是保護作用，促進脊髓損傷的愈合，加快修復部位主要是灰質部位. 治療上可大量使用活血化淤藥。

兔不完全截癱；VEGF陽性表達動態變化；脊髓神經損傷時間的診斷治療依據

截癱，尤其是不完全性截癱，已成為臨床的常見病和疑難病。血管生長因子與神經生長因子一樣，為神經血管再生的重要物質。血管內皮生長因子的促血管新生、促神經再生的作用，已開始運用于創傷愈合的領域中，在大腦彌漫性損傷中的表達已有資料報道①，在脊髓損傷中尚未見資料報道。我們對不完全性截癱兔的損傷脊髓部位的VEGF陽性表達作了動態觀察，現報道如下：

1 材料與方法：

1.1 材料 ①實驗動物與分組：由湖南中醫學院日本大耳白兔飼養中心提供健康雄性日本大耳白兔40只，體重2.0～2.5kg。隨機分為非脊髓損傷組。造模損傷6h組、7天組、15天組，每組10只。②兔不完全性截癱模型的制備采用壓迫法③造成不完全性脊髓損傷。對照組與模型組常規麻醉，顯露第七腰椎間孔切斷黃韌帶，插入麻醉導管膠囊，并用皮膚尾線固定，但不注入典必樂，不予壓迫。24h后拔掉導管。

在模型組形成6h、7d、15d時，空氣栓塞分批處死大耳白兔。電鏡液固定損傷脊髓部位，取3mm長，損傷脊髓用10%的中性福爾馬林固定液再固定，常規石蠟包埋切片。

1.2 主要試劑 兔抗兔VEGF單克隆抗體、SP免疫組織化學試劑盒，DAB顯色劑，由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 VEGF免疫組化染色 ①石蠟切片常規脫蠟至水；②10%過氧化氫37℃孵育10min，微波抗原修復；③羊血清孵育10min，滴加一抗4℃過夜；④滴加二抗37℃孵育30min；⑤滴加三抗37℃孵育30min；⑥DAB顯色蘇木素復染；⑦脫水透明封片。

1.3.2 圖象分析和統計處理 應用美國產Optimas 6.51彩色圖象分析系統（湖南中醫藥大學中醫診斷研究所提供），40×10倍視野顯微鏡下對VEGF免疫組織化學染色陽性反應物進行定量檢測，分別測定損傷脊髓灰質（前、后角，灰質聯共5個視野）和白質（前后索側索共6個視野），灰、白質共11個視野陽性信號數（Var?of Cray）和灰度（Mean Gray）。

用SPSS.11.5統計軟件進行方差分析和q檢驗，P＜0.05視為兩組有顯著性差異。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色顯微鏡下結果 如圖片

2.2 免疫組化圖像分析陽性反應灰度與信號數變化 如表1。

表1 脊髓灰、白質不同階段的動態變化 n=照相張數

如表1所示，正常組VEGF陽性信號的灰度主要表達在脊髓白質（前后側索），陽性表達灰度明顯比灰質高，但顆粒含量差異不顯著。

模型組灰質部位（前角、后角）VEGF陽性信號灰度6h與（非脊髓損傷組）無顯著差異，但陽性信號數開始顯著升高，呈4個時相的最高峰。6h損傷脊髓灰質、白質的灰度與信號數比較顯著差異。白質部位灰度明顯呈下降趨勢，但與正常組無差異，信號數明顯升高呈4h相的最高值。

7d時灰質部位（前角、后角）陽性信號灰度較正常組，顯著升高，表現為四個時相的最高峰，但陽性信號數已開始下降，較6h出現顯著差異。仍明顯高于正常組。白質灰度亦明顯高于6h時，陽性信號數開始顯著下降，明顯低于6h時高于正常組。7d時灰白質、灰度與信號數比較均無顯著差異。

15d時灰質部位（前角、后角）陽性信號灰度，顯著低于7d時灰度，但仍明顯高于6h組和非脊髓損傷組，但信號數又呈升高相，出現四個時相的次高峰。白質部位陽性信號灰度呈下降趨勢明顯低于7d時，信號數又開始升高，出現四個時相的次高峰。灰質與白質灰度比較呈現顯著差異。

3 討論

VEGF在脊髓損傷中的作用：目前，有關VEGF在脊髓損傷中的表達未見詳細資料報道，但在腦損傷修復和腦缺血中有大量資料報道。大鼠彌漫性腦損傷中，在傷后6h陽性信號數達峰值，主要部位在神經元內[1]。與我們所測的資料相一致。本項觀察的第一個峰值也在6h，在灰質白質均有表達，均與非脊髓損傷組出現顯著差異。脊髓損傷7d時灰、白質灰度出現最高值，而顆粒數相對減少這與損傷組織的自然凋亡有關。至15d時顆粒含量出現次高峰，灰質灰度較7d時又開始下降，白質的灰度變化不明顯，從損傷以前15d來看，VEGF表達活躍主要反應在灰質部位。

關于VEGF的神經保護方面的研究近幾年來發展迅速，VEGF是通過內皮細胞上的特異性受體發揮作用，Kilic等[2](2006)發現缺氧時VEGF主要通過其受體(特別是VEGF-2受體)激活P13K/Akt pathway起到保護神經及增加血管通透性的作用。目前發現至少有3種受體與VEGF有關，包括KDR/FLK、FLT1、FLT4。VEGF通過受體結合，增加血管通透性和促進新生血管形成，傷后6h為脊髓損傷的最高峰期主要是脊髓出血，炎細胞浸潤，脊髓水腫時期。這個表現與損傷脊髓血管內皮細胞生長因子陽性信號數呈高峰狀態相一致，亦和光電鏡的表現相一致。一方面VEGF主要是增加血管通透性破壞血腦脊屏障，促進脊髓水腫加重脊髓損傷，另一方面增加脊髓血管通透性，是為促進新生血管形成，改善脊髓血液循環，促進脊髓再生做準備。VEGF第二個高峰是在損傷的15d，增加血管通透性，改善血液循環，增加生殖與遷移，主要是保護作用，促進脊髓損傷的愈合，加快修復部位主要是灰質部位。因為15d灰質部位的灰度又開始出現差異與非脊髓損傷組表現一致。VEGF促進血管生長，增加血氧供應，從而促進細胞存活；VEGF也可直接作用于神經元，抗細胞凋亡、降低氧化應激、調節離子通道、抑制突觸傳遞和細胞興奮性，以及促進神經元再生等。Krum和Khaibullina(2003)[4]發現VEGF是大腦修復中的中心環節，它是血管內皮存活和增生的關鍵。梅欣明等使用當歸注射液治療宮內缺氧大鼠,可上調大鼠大腦皮質VEGFmRNA的表達. 脊髓損傷15d時,治療上可大量使用活血化淤藥。

綜上所述，VEGF四個時相的表現是診斷脊髓損傷分析的高精確靈敏指標，可望為脊髓損傷形成不同階段動態變化時間和修復時間提供參考，并為臨床治療提供指導意義。

[1] 李梅,廖志鋼,王欣,等.大鼠彌漫性腦損傷中血管內皮生長因子表達變化的實驗研究[J].法律與醫學雜志.2002,9(2):96.

[2] 劉潔,胡湘明,劉光國,等,建立兔急性壓迫型不完全性截癱模型的實驗研究[J].湖南中醫學院學報2003,23(5):1.

[3] kilic E,KiLic U,Wang Y,et al. the phosphatidylinositiol-3 kinase/akt pathway mediates VEGF’s neuroprotective activity and induces blood brarrier permeability after focal cerebral ischemia[J],FASEBJ, 2006,20(8)1185-1187

[4] Krum JM,Khaibullina A. Inhibition of endogenbous VEGF impedes revasc ularization and astroglial prolifenration:roles for vegf in brain repair[J].Exp Neurol, 2003,181(2):241-257.

[5] 梅欣明,劉敦玉,趙峰等.當歸對宮內缺氧新生大鼠大腦皮質神經元與VEGFmRNA表達的影響[J].四川動物,2010.vol29(1),2010.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.177

1672-2779（2010）-18-242-03

國家自然科學基金資助項目[No：399709260]

2010-05-28）