復元醒腦湯對高血壓性腦出血大鼠腦組織形態(tài)學改變影響實驗研究※

方邦江 周 爽 陳寶瑾 黃金陽 耿 赟 季學清 郭 全 王宏 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院（0003） 第二軍醫(yī)大學（00433）

復元醒腦湯對高血壓性腦出血大鼠腦組織形態(tài)學改變影響實驗研究※

方邦江1周 爽2陳寶瑾1黃金陽1耿 赟1季學清1郭 全1王宏1
1 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院（200032） 2 第二軍醫(yī)大學（200433）

目的 探討復元醒腦湯對高血壓性腦出血大鼠腦組織形態(tài)學改變的干預作用。方法 將SHR大鼠隨機分為四組，分別為假手術組(n =20)、模型組(n=20)、安宮牛黃膠囊組(N=20)、復元醒腦湯組(N=20)，并與WKY假手術組((n =20)對照。模型組、安宮牛黃膠囊組和復元醒腦湯組在收縮壓達到21.3KPa基礎上以膠原酶加肝素尾狀核注射法誘發(fā)腦出血，建立高血壓性腦出血模型，其中安宮牛黃膠囊組和復元醒腦湯組分別給予相應藥物干預，于造模后連續(xù)灌胃3天。兩假手術組腦內注射及灌胃均為生理鹽水，模型組灌胃為生理鹽水。觀測各組動物神經缺損行為體征、腦組織含水量及病理形態(tài)學改變。結果 SHR模型組與WKY假手術組、SHR假手術組比較，神經缺損行為體征評分升高（均P＜0.01），腦組織含水量增加（均P＜0.01），出現病理形態(tài)學改變；SHR復元醒腦湯和SHR安宮牛黃膠囊兩治療組與SHR模型組比較，神經缺損行為體征評分降低（均P＜0.01），腦組織含水量減少（均P＜0.01），病理形態(tài)學改變明顯改善；上述指標變化復元醒腦湯組與安宮牛黃膠囊組比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。結論 復元醒腦湯可改善高血壓性腦出血大鼠腦組織病理形態(tài)學改變，減輕腦水腫程度，改善神經功能缺損，達到治療高血壓性腦出血的目的。

腦出血；腦水腫；自發(fā)性高血壓大鼠

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SHR大鼠80只，雄性，體重320±20g，SPF級；京都Wista（Wistar Kyoto，WKY）大鼠20只，雄性，體重320±20g，SPF級。由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物合格證：SCXK(滬)2007-005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院科技樓實驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器 膠原酶Ⅶ、Sigma-Aldrich Inc(USA)；肝素、常州千紅生化制藥股份有限公司；RBP-1型大鼠尾壓心率測定儀、北京中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所；ZH-藍星B型腦立體定位儀、淮北正華生物儀器設備有限公司；微量進樣器、上海安亭微量進樣器廠；FA2004B電子天平、上海精密科學儀器有限公司；恒宇電熱恒溫鼓風干燥箱C01-1-BS、上海躍進醫(yī)療器械廠；電熱恒溫水箱（HH-W21-420）、上海躍進醫(yī)療器械廠；LEICA CM1900冰凍切片機、LEICA Inc（GER）；LEICA TP1020自動脫水機、LEICA Inc（GER）；LEICA EG1160自動包埋機、LEICA Inc（GER）。

1.3 實驗藥物 復元醒腦湯（人參9g單煎、三七15g，膽南星15g，大黃9g后下等），由本院制劑室生產提供，濃度為1200g生藥／L；安宮牛黃膠囊由河北安國藥業(yè)集團有限公司生產，0.4g/粒，批號：066401。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 購得動物后，適應性喂養(yǎng)1周，運用大鼠心率血壓計測定大鼠尾動脈收縮壓，SHR大鼠血壓達到21.3KPa以上后，統(tǒng)一稱重，按林氏[1]方法應用SPSS11.5軟件包將SHR大鼠隨機分為SHR假手術組（SHRS，N=20）、SHR模型組(SHRM，N=20)、SHR安宮牛黃膠囊組（SHRTa，N=20）、SHR復元醒腦湯組（SHRTf，N=20）；WKY大鼠為假手術對照組（WKYS，N=20）。

1.4.2 腦出血模型建立 以任氏[2]膠原酶加肝素聯合尾狀核注射誘導的方法建立腦出血動物模型。造模前1日，各組大鼠禁食。大鼠經10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔麻醉。頭頂備皮后俯臥位固定于ZH-藍星B型腦立體定位儀上，正中矢狀切開頭皮，剝離骨膜，調節(jié)門齒托的高度，使動物的前、后囟處于同一水平。頭皮下正中切口約0.8cm，于顱骨背側前囟后0.2mm、中線旁2.9mm處鉆孔，用固定于立體定位儀上的微量進樣器沿鉆孔進針，深約6mm (此處為尾狀核位置)，注射含有0.5U/μl膠原酶Ⅶ和7U/μl肝素的生理鹽水1μl，緩慢退針，鉆孔處填入明膠海綿，縫合皮膚。WKY假手術組與SHR假手術組除注入尾殼核的液體為生理鹽水外，其余步驟同模型組。

1.4.3 藥物干預 SHR復元醒腦湯組于造模成功后，每日按生藥4.22g/kg體重/d給予復元醒腦湯灌胃，每日1次，連續(xù)3天；SHR安宮牛黃膠囊對照組于造模成功后，每日按169mg/kg體重/d給予安宮牛黃膠囊灌胃，每日1次，連續(xù)3天。WKY假手術組、SHR假手術組、SHR模型組于造模成功后每日灌胃生理鹽水1ml，每日1次，連續(xù)3天。

1.5 檢測項目與方法

1.5.1 血壓測定 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，運用RBP-1型大鼠心率血壓計，在大鼠清醒狀態(tài)下經尾動脈測定收縮壓，每只大鼠測3次，取平均值。

1.5.2 神經缺損行為體征觀察 造模后3天，各組大鼠采用Bederson[3]神經體缺損行為體征評分法進行評分。

輕抓鼠尾，提起高于地面1m，正常大鼠前爪伸直。

0 級（0 分）：無神經功能缺損

I級（1 分）：血腫對側前肢回收屈曲于腹下，同側前肢向地面伸展

II級（2 分）：I級體征+俯臥于桌面時從血腫側向對側推大鼠時阻力降低

III級（3 分）：I級體征+II級體征+大鼠行走時向血腫對側肢體旋轉(呈追尾狀)

1.5.3 腦組織含水量測定 腦組織含水量(Brain Water Content,BWC)采用干濕腦重法測定。造模后3天，每組各取6只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，迅速開顱取腦，取血腫周圍腦組織（WKY假手術組和SHR假手術組取相應部位腦組織），電子天平先稱取濕重，放入電熱恒溫鼓風干燥箱100℃烘烤24h，再稱取干重，計算腦組織含水量：

1.5.4 腦組織病理學觀察 造模后3天，每組各取3只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟，灌注針頭從左心室插至主動脈根部，在右心耳處剪開作為出口，迅速灌注生理鹽水總量約200ml，至右心耳流出液體無血色后，灌注4%多聚甲醛，至大鼠四肢變硬，口唇、內臟變白，迅速開顱取腦。取病灶側（SHR假手術組和WKY假手術組取相應部位）腦組織置于10%中性甲醛溶液中固定，經梯度酒精序列脫水、浸蠟、石蠟包埋，切5μm片，蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色，光學顯微鏡下觀察皮層組織形態(tài)學改變。

1.6 統(tǒng)計分析 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示，組間均數比較采用方差分析；等級資料采用Ridit分析[4]。檢驗效能以P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為差異具有非常顯著性。

2 結果

2.1 神經缺損行為體征評分 由表1可見各組大鼠神經缺損行為體征評分情況：SHR假手術組與WKY假手術組比較差異無顯著意義（P＞0.05）；SHR模型組、SHR安宮牛黃膠囊組和SHR復元醒腦湯組與WKY假手術組、SHR假手術組比較均具有非常顯著差異（P＜0.01）。SHR安宮牛黃膠囊組、SHR復元醒腦湯組與SHR模型組比較均具有顯著差異（P＜0.01）；SHR安宮牛黃膠囊組與SHR復元醒腦湯組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠神經缺損行為體征評分

2.2 腦組織含水量 由表2可見，各組大鼠腦組織含水量情況：SHR假手術組與WKY假手術組比較差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；SHR模型組、SHR安宮牛黃膠囊組和SHR復元醒腦湯組與WKY假手術組、SHR假手術組比較具有非常顯著差異（P＜0.01）；SHR安宮牛黃膠囊組和SHR復元醒腦湯組與SHR模型組比較均具有非常顯著差異（P＜0.01）；SHR復元醒腦湯組與SHR安宮牛黃膠囊組比較無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腦組織含水量 (X±s)

2.3 腦組織病理形態(tài)學改變

WKY假手術組大鼠大腦皮層神經細胞排列緊密，胞漿淡染，核仁清楚；SHR假手術組大鼠大腦皮層神經細胞形態(tài)及數目與WKY假手術組基本相同，可見部分血管壁增厚；SHR模型組大鼠大腦皮層神經細胞數量明顯減少，細胞腫脹嚴重、排列紊亂，大量神經細胞變性，結構不清，血管內皮細胞腫脹，管腔內血細胞聚集嵌塞微血管，細胞間隙空化明顯；SHR復元醒腦湯治療組大鼠和SHR安宮牛黃膠囊組大鼠大腦皮層神經細胞腫脹程度減輕，微血管內皮細胞的損傷顯著減輕，膠質細胞增多。（見附圖）

3 討論

腦出血，屬中醫(yī)“中風”的范疇。中醫(yī)學有關中風的記載，始見于《內經》。唐宋以前，諸家皆從內虛邪中之說；金元以降，火、虛、痰等論始發(fā)其端；及至明清，內傷積損、氣虛血瘀、肝陽化風、血氣上逆等說愈發(fā)豐富。其病因多認為與風、火、痰、虛、瘀密切相關。我們在長期臨床過程中發(fā)現，中風大多為中老年人，正氣虧虛為中風的基礎。《雜病源流犀燭·中風源流》云：“人至五六十歲，氣血就衰，乃有中風之病”。《景岳全書·非風》云：“卒倒多由昏憒，本皆內傷積損頹敗而然”。氣虛則痰瘀內生，痰、瘀分別是津、血的病理產物，一旦生成，又成為新的病理過程啟動之因。痰是水液代謝障礙形成的病理產物，痰的生成同脾腎功能密切相關。腎者主水，腎氣不足則水液蒸騰氣化無力，聚而為痰；脾主運化，脾不健運則水濕不化，痰濁內生。“氣為血之帥”，氣虛無力推動血液運行而為瘀血。痰、瘀又可相互促生，膠著為患。痰瘀內阻，郁而化熱，熱極生風；或陰血虧虛，水不涵木，肝陽化風，風火相煽，發(fā)為中風。針對中風“正氣虧虛、痰瘀互結、風火相煽”病機，采取復元醒腦為主，佐以逐瘀化痰、泄熱息風等促進醒腦開竅之法，自擬復元醒腦湯治療腦出血取得良好臨床療效。本方人參、三七、大黃、膽南星等藥共用。人參大補元氣，補脾益肺，脾氣健運，肺氣宣暢，則痰濁自消，氣為血帥，氣盛血行，瘀血自消，可達扶正祛邪之目的，為治本之藥；三七止血不留瘀，針對出血性中風止血，并且可以達到化瘀目的；大黃通腑瀉下，清熱解毒，兼具活血化瘀之功，與三七合用一通一澀，止血不留瘀；膽南星清熱化痰，息風定驚。諸藥合用，方小力專，起“復元醒腦、逐瘀化痰、泄熱熄風”之功。

既往對于中醫(yī)藥對腦出血干預作用的實驗研究表明[5,6]，中藥對腦出血大鼠神經功能有較好的改善作用，同時能明顯降低大鼠腦水腫程度。本實驗結果證實模型組大鼠神經缺損行為顯著惡化，腦組織含水量顯著增加，表明腦出血后腦水腫在病情進行性加重過程中發(fā)揮重要作用，腦水腫程度越重病情越兇險。安宮牛黃丸為臨床治療腦出血急性期常用中成藥，相關研究表明安宮牛黃丸可以顯著減輕腦出血后腦水腫程度及神經缺損行為[7,8]。復元醒腦湯可以減輕皮層神經細胞腫脹程度，炎性細胞浸潤和微血管內皮細胞的損傷亦顯著減輕，降低高血壓性腦出血大鼠腦組織含水量，進而改善神經缺損行為，并且其對腦水腫程度及神經缺損行為改善具有和安宮牛黃膠囊等同的效果。

附圖 各組大鼠病理形態(tài)學改變

圖1 WKYS(×200)

圖2 SHRS(×200)

圖3 SHRM(×200)

圖2 SHRS(×200)

圖4 SHRTa(×200)

圖5 SHRTf(×200)

[1] 林漢生,夏蘇建.利用SPSS進行隨機化實驗設計分組[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計, 2005,22(6):397-398.

[2] 任澤光,吳建中.大鼠腦出血模型[J].中華神經外科雜志,1993,9(4): 205-206.

[3] Berderson JB,Piths LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination [J]. Stroke,1986,17:472-476.

[4] 武松,葉冬青.多組單向有序資料的Ridit分析在SPSS中的實現[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計,2006,23(6):554.

[5] 樊永平,胡磷媛,趙性泉.β-七葉皂昔鈉對大鼠腦出血后腦水腫的干預作用[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2008,31(7):470-473

[6] 秦峰,王長松,晉光榮,等.犀角地黃湯對大鼠腦出血后腦水腫及行為學影響的研究[J].中國中醫(yī)急癥,2008,17(6):801-803

[7] 方芳,孫建寧,楊莉,等.安宮牛黃丸全方及簡方對大鼠腦出血損傷的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2007,30(9):611-614.

[8] 殷妮娜,孟運蓮,王秋桂.安宮牛黃丸對大鼠腦出血后血腫周圍腦組織含水量的影響[J].咸寧學院學報(醫(yī)學版),2007,21(3):196-199.

The Experimental Study of Fuyuan Xingnao Decoction on Blood-brain Barrier Permeability in Hypertensive Cerebral Hemorrhage Rats

LIN Mei1FANG Bang-Jiang2ZHOU Shuang3CHEN Bao-Jin2HUANG Jin-Yang2GENG Yun2JI Xue-Qing2GUO Quan2WANG Hong2
Department of Chinese Medicine,Central Hospital of Xuhui District,Shanghai,China Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Second Military Medical University

Objective To study the effect of Fuyuan Xingnao Decoction on pathomorphology change in Hypertensive Cerebral Hemorrhage Rats brain tissue.Methods Spontaneously Hypertensive Rats were randomly divided into four groups,sham operation group(SHRS,N=20),model group(SHRM,N=20),Angong Niuhuang capsule group(SHRTa,N=20),and Fuyuan Xingnao Decoction group(SHRTf,N=20),compared with Wistar Kyoto rats sham operation group(WKYS,N=20).After the systolic pressure stabilizing in 21.3KPa,SHRM,SHRTa and SHRTf were induced cerebral hemorrhage by caudate nucleus injection with collagenase and heparin.Then SHRTa and SHRTf were given corresponding drugs in intragastric administration for three days after getting into cerebral hemorrhage,while SHRS and WKYS were all given intracerebral injection and intragastric administration with physiological saline,and SHRM was given intragastric administration with physiological saline.Rats of all groups were observed respectively their behavior and physical signs of neurologic defect,brain tissue moisture capacity and pathomorphology change.Results Compared with WKYS group and SHRS group,the SHRM group behavior and physical signs of neurologic defect grades,brain tissue moisture capacity increased up（P＜0.01），presented pathomorphology change in brain tissue；SHRTa group and SHRTf group compared to SHRM group,behavior and physical signs of neurologic defect grades,brain tissue moisture capacity lowered（P＜0.01）,and pathomorphology change in brain tissue obviously improved；there is no statistical significant difference between SHRTa group and SHRTf group on the index changes（P＞0.05）.Conclusion Fuyuan Xingnao Decoction may achieve the purpose of treating hypertensive cerebral hemorrhage through improve pathomorphology change in brain tissue obviously,relieve cerebral edema,and improve neurologic impairment.

Cerebral Hemorrhage；Cerebral Edema；Spontaneously Hypertensive Rats

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.136

1672-2779（2010）-18-0182-03

腦出血（Cerebral Hemorrhage，CH）是指原發(fā)性腦實質的非創(chuàng)傷性出血，是臨床常見的腦血管疾病，主要病因是高血壓。高血壓伴發(fā)腦內小動脈病變，當血壓驟升時破裂出血，稱為高血壓性腦出血。腦出血后引起機體和腦組織局部發(fā)生系列病理生理學反應，在血腫周圍腦組織形成水腫帶，繼而引起神經細胞及其軸突的變性和壞死。腦出血后腦水腫的預防和治療為臨床實踐中重要一環(huán)，在降低患者死亡率和致殘率、改善患者生活質量方面起重要作用。臨床應用復元醒腦湯治療腦出血取得顯著臨床效果，為了進一步探討復元醒腦湯治療腦出血的作用機理，本實驗擬在建立高血壓性腦出血大鼠模型基礎上，觀測復元醒腦湯對其神經功能缺損、腦組織含水量、腦組織病理形態(tài)學改變的干預作用。

上海市公共衛(wèi)生新三年行動計劃項目（No.G200720）

2010-07-30）