補陽還五湯對老年黃斑變性實驗性大鼠的干預研究

劉中文 潘曉燕 孔炳華 鐘秀鳳 吳君舒中山大學中山眼科中心·眼科學國家重點實驗室（510060 ）

補陽還五湯對老年黃斑變性實驗性大鼠的干預研究

劉中文 潘曉燕 孔炳華 鐘秀鳳 吳君舒
中山大學中山眼科中心·眼科學國家重點實驗室（510060 ）

目的 探討補陽還五湯對老年黃斑變性實驗性大鼠的防護作用。方法 Sprague—Dawley(SD)大鼠隨機分為三組：正常對照組、陽性對照組、補陽還五湯治療組。通過2000Lux白色冷光源對SD大鼠進行24h持續性照射，建立視網膜光損傷模型。采用食道灌胃進藥方法，于光照前24h及光照前30min2次用藥。觀察視網膜組織形態學改變；ERG檢查視網膜功能；檢查視網膜超氧化物歧化酶（superocide disnutase，SOD）活力及丙二醛（Malondialdehyde，MAD）和一氧化氮（Nitric Oxide，NO）的含量。結果 ①形態學檢查：陽性對照組光感受器內外節排列紊亂，分界不清，外節膜盤疊狀結構解離，呈空泡狀變性，內節線粒體腫脹、內嵴增寬，外核層水腫、變性、變薄，約5-6個細胞核厚度，染色質聚集，核膜皺縮，可見較多染色質濃染及凋亡細胞。補陽還五湯治療組視網膜結構清晰，內外節分界清楚，外核層排列整齊，約10～11個細胞核厚度，未見明顯凋亡細胞改變。②ERG檢查：正常大鼠ERG暗視混合反應b波振幅為268.663±95.252μν，陽性對照組b波振幅下降到光照前的29.68%，補陽還五湯治療組b波振幅圖是個升高到63.37%（P＜0.05）。③SOD、MDA、NO檢測：正常組SOD4.218±0.512U/gprot，陽性對照組SOD活力下降（P＜0.05），補陽還五湯治療組與陽性對照組對比其SOD活力明顯升高（P＜0.05）。正常對照組MDA、NO含量分別為0.139±0.023nmol/mgprot，0.282±0.046μmol/gprot陽性對照組MDA、NO含量明顯升高（P＜0.05），而補陽還五湯治療組與陽性對照組對比，其MDA、NO含量明顯下降（P＜0.05）。結論 補陽還五湯可通過改善視網膜光損傷后的氧化應激狀態，保護線粒體，改善能量代謝障礙，保護視網膜功能，實現對老年黃斑變性的防護。

補陽還五湯；老年黃斑變性；視網膜；自由基

老年黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是黃斑區視網膜組織退行性病變，視網膜是視覺形成的重要結構，同時也是容易受到光損傷的部位。AMD發病機制與長期低強度光照的積累效果有關[1]，視網膜損傷的發生部位也與AMD等病的病理改變近似[2]，外層視網膜，尤其是光感受器外段最早受累。Klein等[3]發現，各種類型的AMD患病率隨著年齡的增加而升高。而對于這種嚴重危害視力的疾病，目前尚無理想的治療措施。因此防治AMD的研究對于防盲治盲具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用健康無眼病成年SD大鼠42只，雄性，體重180～220g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。隨機分為3組：正常對照組，陽性對照組，補陽還五湯組，每組各14只。

1.2 視網膜光損傷模型的制備 自制無色透明有機玻璃光照箱，20cm×20cm×20cm.光照箱四面具有排風孔。懸掛于自制光照架內，光照架的6個面分別放置一根白色冷光源熒光燈管。調節各熒光燈與光照箱之間的距離，使箱內各箱壁處光照強度為（2000±100）Lux（ST-80A數字式光照度檢測儀，上海大光電儀器廠出產），箱內中心各方向照度 2000Lux，工作溫度控制在22～25℃左右。所有試用大鼠均在12h明（30～50Lux）12h暗的明暗循環光環境中適應7天，光照前暗適應24h，然后逐只進入光照箱，接受24h持續光照射（早上8:00一次日早上8:00）。大鼠未經散瞳及麻醉，不限制活動和飲食，光照后送回暗環境中飼養。

1.3 給藥方案 所有動物采用經食道灌胃進藥方法。于光照前24h及0.5h給藥，共2次。補陽還五湯組藥物劑量：900mg/(kg·d)，藥物濃度為60mg/ml，正常對照組及陽性對照組大鼠每只灌水3ml滅菌水。

1.4 視網膜電圖 使用日本Nihon Kohden公司產的Nerropack II MEB-5100型電生理儀記錄視網膜電圖（electroretinogram.ERG）信號反應。通頻帶0.5～100Hz，掃描時間100ms。刺激器為美國LKC公司產的2503型全視野刺激器，GrassPs22型閃光刺激器提供閃光。選用I1610.72cd.s/m2強度的閃光刺激記錄暗視閃光ERG。參照ISCEV2004電生理檢查標準，所有ERG操作均在微弱的紅光下暗室內進行。動物暗適應2h后，雙眼用復方托品酰胺眼液點眼一次散大瞳孔，5min后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，復方托品酰胺再點眼一次。待大鼠呼吸平穩，進入麻醉狀態后，雙眼點1%丁卡因表面麻醉。將大鼠固定于檢查臺上，測量眼安放自制環狀鉑金線電極（直徑約占0.5mm）盡量與角膜接觸，加1%甲基纖維素以潤滑。參考電極為針狀置舌下，接地電極置與尾部，用酒精擦拭皮膚，盡量使電極與皮膚接觸。操作時關紅光，單次白色閃光刺激，每眼測3次，每次間隔20秒。記錄暗視混合反應，測b波振幅并進行統計分析。

1.5 視網膜組織形態學觀察 光鏡檢查步驟：10%水合氯醛溶液(5ml/kg)腹腔注射深度麻醉動物，于眼球的12點鐘方位縫線標記定位，斷頸處死后立即取眼球，投入混合固定液(冰醋酸、甲醛、蒸餾水和95%乙醇按l:2:7:10配置)中固定，3小時后轉移至4%多聚甲醛中固定過夜；沿標記縫線─視神經連線對剖眼球并取其顳側，除去晶體，再沿標記縫線─視神經對剖取上方眼球；梯度酒精脫水；二甲苯透明；石蠟包埋；經視乳頭旁開lmm縱向切片，制成5μm厚的切片；常規脫蠟，雙蒸水水化，行常規蘇木素一伊紅(HE)染色；中性樹脂封片。用數字攝像系統采集照片。電鏡檢查步驟如下：10%水合氯醛溶液(5ml/kg)腹腔注射深度麻醉動物，斷頸處死后立即摘除眼球，常規于3%戊二醛中固定過夜，在解剖顯微鏡下，去除眼前節，保留眼杯，取視乳頭顳側lmm上方眼球壁全層1mm×lmm，再以1%四氧化鋨后固定，丙酮及酒精逐級脫水，環氧樹脂EPON812包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，日立H-600透射電鏡作超微結構觀察及選擇滿意部位拍片。

1.6 視網膜組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)、一氧化氮(N0)的含量的測定 試劑：考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、SOD、MDA、N0試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。步驟：10%水合氯醛腹腔注射麻醉后脫頸椎法處死動物，迅速摘除眼球。在冰環境中環形切開角鞏膜緣，棄去眼前節和晶狀體，外翻眼球壁，在解剖顯微鏡下全層鈍性剝離視網膜，將同一大鼠兩個眼球的視網膜組織合并作為一個標本，用濾紙吸去表面液體，以精密分析天平稱取視網膜濕重，再用冰生理鹽水配成2%的濕重，超聲粉碎后勻漿。勻漿液于4℃低溫離心機以3500rpm離心15min，取出上清液。首先測標本蛋白量，操作步驟按考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒說明。紫外分光光度計測標準管和測定管的吸光度，得出標準曲線的相關度(R2)須≥0.98且測定管蛋白濃度范圍在0.3～0.7之間才進行SOD、MDA、N0檢測。總SOD采用黃嘌呤氧化酶法測其活力，MDA采用硫代巴比妥酸法測其含量。N0采用硝酸還原酶法將NO3-還原為NO2-，比色法測定其濃度。

1.7 統計學分析 所有統計學分析采用SPSS10.0醫學統計軟件進行，結果以均數±標準差表示，各組均數比較采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ERG檢測 光照前后每只大鼠每個眼均測量3次，取其中間值為記錄值。正常大鼠ERG暗視混合反應b波振幅為（268.663±95.252）μν，陽性對照組b波振幅下降到（80.986 ±26.286）μν，為光照前的29.68%，與正常組別比較差異有顯著性（P＜0.05），補陽還五湯組ERG暗視混合反應b波振幅分別為光照前的63.37%，與正常組比較差異有顯著性（P＜0.05），與陽性對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）。見表1

2.2 形態學觀察 ①正常對照組 光鏡：視網膜形態正常，結構層次清楚，光感受器內外節排列整齊規則，分層清楚，結構清晰，著色均勻，外核層形態規整，約有12～13個細胞核厚度，RPE層排列整齊，形態正常。電鏡：外節膜盤密集呈板層狀整齊排列；內節線粒體豐富，排列規則，嵴連續，結構清晰，呈卵圓形或長梭形；外核層細胞核形態規則，染色質分布均勻。②陽性對照組 光鏡：視網膜內、外節排列紊亂，分界不清，外節結構模糊，疊狀結構解離，呈空泡裝變性，未見正常結構；內節線粒體腫脹，內嵴增寬；外核層水腫、變性、變薄，每5～6個細胞核厚度，細胞間隙較大，染色質聚集，核膜皺縮，可見較多固縮細胞核。電鏡：光感受器外節膜腫脹模糊，排列紊亂，膜間隙較大，出現分離、崩解、空泡變性；內節線粒體腫脹，嵴端斷裂，部分空泡變性；外核層大量核膜皺縮、內陷，染色質聚集、濃度不均，可見較多凋亡細胞。③補陽還五湯組光鏡：視網膜結構破壞較輕，內、外節分界清楚，結構清晰，外核層排列整齊，約10～11個胞核厚度。電鏡：視網膜損傷輕，僅表現為外節膜盤排列輕度紊亂，內節線粒體輕度腫脹，外核層未見明顯凋亡細胞的改變。各組視網膜RPE層排列較整齊形態規整，未見明顯病理改變。內核層、節細胞層未見明顯病理改變、炎癥及壞死細胞。

2.3 SOD活力、MDA、NO檢測 大量研究表明，視網膜光損傷是由于機體代謝失調，通過酶系統和非酶系統產生自由基，引發脂質過氧化，導致一系列損害所致。如表2所示，陽性對照組SOD活力較正常對照組明顯降低（P＜0.05），MDA和NO的含量明顯升高（P＜0.05），經過補陽還五湯治療后，大鼠視網膜光損傷后SOD活力較陽性對照組有明顯提高（P＜0.05），NO的含量和MDA含量較陽性組有顯著下降（P＜0.05）。(見表2)

表1 ERG暗視混合反應b波振幅改變

3 討論

老年黃斑變性是多發于45歲以上，患者的黃斑區視網膜組織退行性病變，包括黃斑區脈絡膜玻璃膜疣，視網膜色素上皮區域性萎縮、黃斑區脈絡膜新生血管膜、視網膜色素上皮細胞脫離、黃斑區盤狀退行性變或盤狀瘢痕等。視網膜是大腦的延伸，光感受器細胞也是終末分裂的神經細胞，有著復雜的神經活動。故我們考慮視網膜疾病的治療可借鑒神經系統疾病的治療方法。

表2 視網膜SOD活力、MDA、NO檢測

視網膜光損傷是光照激發產生自由基，引起組織發生過氧化的結果[4]。一氧化氮(nitricoxide，NO)是一種活性很強的自由基，一種新型的神經遞質，它參與機體多種生理和病理過程，內源性NO產生于L—精氨酸(L—arginine，L-Arg)的末端，其化學反應需要一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的催化，NOS有神經元型、誘導型和內皮型3種異構體，為合成NO的限速酶，廣泛分布于視網膜的各層細胞中，正常生理狀態視網膜組織中有NOS的表達，含NOS部位的NO可維持低濃度參與血液循環的調節和視覺信息的傳遞，但在某些病理狀態下，視網膜內NOS表達可能增加，產生過量的NO，而高濃度的NO對視網膜組織具有毒性破壞作用[5]，由于NO在體內的半衰期短(5～10s)，迅速氧化生成穩定的亞硝酸鹽(NO2-)和硝酸鹽(NO3-)，故可以通過測定NO2-/NO3-來間接地反映組織內的NO濃度[6,7]。視網膜受到光刺激后，視紫紅質吸收光子，激發電離，產生大量自由基。NO與超氧自由基結合，分解出毒性更大的羥基自由基，NO還可通過被動轉運很快離開細胞，而對鄰近細胞產生毒性作用，此外還可通過介導谷氨酸等興奮性氨基酸導致其受體依賴性鈣通道的開放，致使Ca2+大量內流，而引起NOS活性升高，進而導致NO合成增多[8]。同時NO大量的釋放又可造成神經組織的損害，反過來促使興奮性氨基酸的釋放，二者形成了惡性循環，加重對視網膜的損傷。在此過程中NOS成為二者聯結的關鍵。過量的NO還可產生神經毒性作用，主要在于：①NO可引起細胞亞硝酸化，破壞DNA的螺旋結構，導致細胞損傷。②NO可與超氧陰離子反應生成超氧亞硝酸根離子，后者及其分解產物羥自由基可引起細胞毒性損傷。③NO可與含亞鐵原卟啉基因的鐵原子結合，形成亞硝酰鐵絡合物，從而抑制某些與細胞呼吸和DNA復制有關的關鍵酶的活性[9]。光損傷時過多的NO可生成過氧亞硝基，后者具有極強的氧化攻擊力，使超氧化物歧化酶(Superocide Disnutase，SOD)發生酪氨酸硝基化而失活，從而破壞細胞的抗氧化系統并最終導致氧化損傷[10]。因此認為NO在視網膜光損傷起重要作用[11]。

補陽還五湯(黃芪60g，當歸尾6g，地龍3g，赤芍藥6g，川芎3g，桃仁3g，紅花3g )由補氣藥和活血祛瘀藥相配伍而成。臨床研究表明對腦血栓、腦動脈硬化、冠心病等有確切療效[11,12]。補陽還五湯能減少損傷過程中一氧化氮和氧自由基的生成，提示對心肌細胞的保護機制與清除氧自由基、抑制脂質過氧化作用有關[14]。本課題研究表明，補陽還五湯可通過改善視網膜光損傷后的氧化應激狀態，保護線粒體，改善能量代謝障礙，保護視網膜功能，實現對老年黃斑變性的防護。

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10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.168

1672-2779（2010）-18-0230-03

廣東省衛生廳中醫藥管理局 [No:2008090]

2010-07-13）