重組微小毛霉凝乳酶的發酵條件及其酶學性質

李玉秋，王景會，李鐵柱，張 莉，楊貞耐*

重組微小毛霉凝乳酶的發酵條件及其酶學性質

李玉秋，王景會，李鐵柱，張 莉，楊貞耐*

(吉林省農業科學院農產品加工研究中心，吉林 長春 130033)

通過對重組微小毛霉凝乳酶(recombinant Mucor pusillus rennet，RMPR)發酵條件的研究，確定甲醇誘導體積分數1%、初始OD600nm0.5、裝瓶量100mL/500mL搖瓶、誘導時間96h為發酵最適條件。培養液離心取上清用硫酸銨分級沉淀獲得粗酶液，并對其酶學性質進行研究，經測定該酶的最適反應溫度為60℃，30～45℃酶較穩定，保溫90min，剩余凝乳酶活力達86.5%；酶在pH5.5～7.0范圍內，隨pH值升高，凝乳酶活力逐漸降低，pH5.5時凝乳酶活力最高。當Ca2+濃度為0.03mol/L時凝乳酶活力最高，Na+濃度對凝乳酶活力沒有明顯影響，Ni2+和Fe2+對酶有抑制作用，Mn2+、K+、Mg2+對酶有一定的促進作用。

微小毛霉；凝乳酶；酶學性質；發酵；重組

小牛皺胃酶(calf rennet)主要用于干酪等制品的生產，但世界市場需求量日益增長，每年宰殺4000萬頭犢牛，仍不能滿足需要[1-2]。目前各國都在不斷尋找替代品，植物蛋白酶、其他動物蛋白酶和微生物蛋白酶，雖然起到凝乳作用，但各有弊端，動物源凝乳酶所制干酪風味差、品質低；植物蛋白酶和微生物蛋白酶表現出專一性不強、凝乳活性與分解活性比值低、對熱穩定、在乳中殘留量高等問題，常常引起加工的干酪產量降低，成熟后出現苦味或其他不良風味[3]。利用基因工程技術，將凝乳酶原的基因克隆并在適當的宿主細胞中表達，并可以按照人們的意愿改造凝乳酶，使其具有牛凝乳酶的優良特性，從而拓寬了凝乳劑的來源，解決凝乳劑不足的現象[4-6]。

畢赤酵母表達系統是近年來發展很快的一個真核表達系統，它既具有原核表達系統操作簡單、易于培養、生長速度快、表達量高、成本低等優點，還具有真核生物表達系統的對外源蛋白的翻譯后修飾等特點，如糖基化、蛋白磷酸化等[7]。此研究利用畢赤酵母表達系統表達微小毛霉凝乳酶，對其發酵條件進行優化，并從溫度、pH值、底物質量分數、金屬離子濃度對酶活力的影響對其進行研究，為工業化發酵生產重組微小毛霉凝乳酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳奶粉、新西蘭進口脫脂乳粉 金財公司分裝。

酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、甘油、生物素、甲醇 北京化工廠；酵母氮源(YNB) 美國BD公司。

1.2 菌種與培養基

畢赤酵母工程菌GS115/pPICZαA-MPR由本實驗室構建保存。

種子培養基(YPD，g/100mL)：酵母提取物1、蛋白胨2、葡萄糖2[8]；發酵基礎培養基(BMGY)：酵母提取物1g/100mL、蛋白胨2g/100mL、YNB 1.34g/100mL、生物素0.5g/100mL、甘油體積分數1%、0.1mol/L磷酸鉀(pH6.0)[7]；發酵誘導培養基(BMMY)：酵母提取物1g/100mL、蛋白胨2g/100mL、YNB 1.34g/100mL、生物素0.5g/100mL、甲醇體積分數0.5%、0.1mol/L磷酸鉀(pH6.0)。

1.3 方法

1.3.1 重組菌的培養

挑取單菌落加入100mL YPD培養基中30℃、240r/min培養16h，獲得種子培養液，1:100(V/V)轉接入BMGY中，30℃、240r/min培養至OD600nm值達2～6之間，按不同接種量、不同裝瓶量接入BMMY，以不同甲醇體積分數開始誘導，每24h補加甲醇1次，并每隔24h取樣1次，測定酶活性[9]。

1.3.2 粗酶液的制備

取1000mL誘導表達的酵母培養液離心后取上清，先加入硫酸銨164g，4℃攪拌沉淀過夜(16h)，4℃、8000 r/min離心10min，取上清液再加入硫酸銨181g，4℃攪拌沉淀過夜(16h)，4℃、8000r/min離心10min，沉淀溶于0.05mol/L磷酸鈉緩沖液中，即粗酶液。

1.3.3 凝乳酶活力測定

根據改進的Magda等[10]方法，將脫脂乳用0.01mol/L CaCl2配制成質量分數為10%的復原脫脂乳溶液。35℃條件下，取待測酶液0.2mL加入2mL質量分數為10%的復原脫脂乳中，充分混勻，開始計時，至絮狀凝集顆粒出現為止。在35℃、40min，凝固1mL 10%脫脂奶粉的酶量為一個酶活力單位。

式中：D為酶液稀釋倍數；t為凝乳時間/s；2400為時間2400s即40min。

式中：A為所測的凝乳酶比活力/(U/mL)；A0為對照的凝乳酶比活力/(U/mL)。

1.3.4 酶學性質測定方法

1.3.4.1 凝乳酶的最適溫度和熱穩定性

分別取復原脫脂乳2mL，加入0.2mL待測酶液，分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃條件下測定凝乳酶活力，脫脂乳和酶液預先在相應的溫度下保溫2min，然后測定凝乳酶活力，以最大凝乳酶活力為100%作為對照，確定凝乳酶的最適反應溫度。

將待測酶液分別在30、35、40、45、50、55、60、65℃條件下保溫10、20、30、40、50、60、90、120min后，吸取0.2mL加入2mL 35℃預熱的復原脫脂乳中，測定凝乳酶活力。以未處理前測得的凝乳活力為100%作為對照，測定凝乳酶的熱穩定性。

1.3.4.2 凝乳酶的最適pH值及不同pH值下的穩定性

分別取復原脫脂乳10mL裝入三角瓶中，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液分別調pH值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0[11]。取2mL上述脫脂乳，加入0.2mL待測酶液在35℃條件下測定凝乳酶活力[10]，以最高凝乳活力為100%作為對照，測定凝乳酶反應的最適pH值。

分別取10mL待測酶液，用檸檬酸鈉緩沖液調pH值至3.0、4.0，用磷酸緩沖液調pH值至6.0、7.0，用Tris-HCl緩沖液調pH值至8.0、9.0、10.0[12]。室溫放置20h后，用HCl溶液和NaOH溶液將pH值調至6.0，35℃條件下測定凝乳酶剩余酶活力，以未經處理酶液測得的酶活力為100%作為對照，確定凝乳酶在不同pH值下的穩定性。

1.3.4.3 底物質量分數對凝乳酶活力的影響

分別取待測酶液加入到質量分數5%、10%、12%、15%、20%的復原脫脂乳中，35℃條件下測定凝乳酶活力，以最高凝乳酶活力為100%作為對照。

1.3.4.4 鈣離子和鈉離子濃度對凝乳酶活力的影響

分別用不同濃度的CaCl2(5～500mmol/L)配制10%復原脫脂乳[13]，取2mL加入0.2mL待測酶液，35℃條件下測定凝乳酶活力，以未添加Ca+離子的脫脂乳測得的酶活力為100%作為對照。分別用不同濃度的NaCl溶液(10～300mmol/L )配制10%復原脫脂乳[13]，取2mL加入0.2mL待測酶液，35℃條件下測定凝乳酶活力，以未添加Na+離子的脫脂乳測得的酶活力為100%作為對照。

1.3.4.5 其他金屬離子對凝乳酶活力的影響

將復原脫脂乳配制成含各種金屬離子(Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Fe3+、Fe2+、Mg2+)濃度為5mmol/L；在35℃條件下測定酶的相對凝乳酶活力，以未添加金屬離子的脫脂乳測得的酶活力為100%作為對照。

2 結果與分析

2.1 重組菌發酵條件優化

2.1.1 初始光密度值對產凝乳酶活力的影響

將種子液接于BMMY(pH6.0)中，OD600nm分別為0.5112、1.073、1.538、2.037、2.568，裝瓶量為100mL/500mL搖瓶，30℃、240r/min，甲醇誘導體積分數為1%，每24h補加1次并取樣測定凝乳酶比活力，72、96、120h分別取樣測定凝乳酶比活力，結果見圖1。

圖1 初始光密度值對凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of initial OD600nmvalue on rennet activity

如圖1所示，起始OD600nm為0.5時，誘導72h后RMPR即可達到較高的凝乳酶比活力，誘導120h凝乳酶比活力達最大。起始OD600nm為1.0、1.5、2.0、2.5時誘導72h，RMPR活力較低，當誘導120h后凝乳酶比活力最佳，但仍顯著低于起始OD600nm為0.5、誘導120h的RMPR達到的凝乳酶比活力，可見重組菌OD600nm為0.5時為最佳起始光密度值。

2.1.2 裝瓶量對凝乳酶活力的影響

將種子液接入BMMY中，OD600nm為1.085，500mL搖瓶裝量分別為50、100、200、300mL，30℃、240 r/min培養144h，甲醇體積分數為1%，每24h補加一次并取樣測定凝乳酶比活力，連續培養144h，每隔24h取樣并測定凝乳酶比活力，結果見圖2。

圖2 裝瓶量對凝乳酶活力的影響Fig.2 Effect of volume of medium contained in 500 mL flask on rennet activity

如圖2所示，裝瓶量為100mL效果最佳，誘導144h后凝乳活力最高。50mL裝瓶量誘導144h，每隔24h取樣一次，均沒有檢測到凝乳活力，可能由于裝瓶量低，菌體溶氧量過高，菌株生長過于旺盛，分泌其他水解蛋白酶類，降解其表達的外源蛋白，致使外源蛋白水解不表現活性。裝瓶量為100、200、300mL時，誘導24h酶比活力大致相同；隨誘導時間增加，裝瓶量200mL和300mL發酵重組酶活力明顯低于100mL裝瓶量RMPR的比活力。裝瓶量過高，致使酵母溶氧量過低，菌體生長速度較慢，菌體狀態不佳，影響重組蛋白表達。

2.1.3 甲醇體積分數對凝乳酶活力的影響

將種子液接入BMMY中，OD600nm為1.102，裝瓶量為100mL/500mL搖瓶，30℃、240r/min，甲醇體積分數分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，每24h補加1次，誘導144h，每隔24h取樣測定凝乳酶比活力。

圖3 甲醇體積分數對凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of methanol concentration on rennet activity

如圖3所示，當甲醇體積分數為1%時，重組凝乳酶比活力最佳，明顯高于其他甲醇體積分數誘導的凝乳酶比活力。當用1.5%的甲醇時，重組凝乳酶活力稍低，但明顯高于0.5%和2.0%的甲醇時的凝乳酶比活力。當用2.0%甲醇時對凝乳酶比活力有較大的影響，誘導72h以后重組凝乳酶比活力逐漸降低，可見甲醇體積分數過高影響酵母的生長狀態，對酵母產生一定毒害的作用，抑制酵母生長，所以甲醇體積分數不易過高。

2.1.4 最佳誘導時間的確定

圖4 產酶最佳誘導時間對凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of incubation time on rennet activity

將種子液接種于BMMY(pH6.0)中，OD600nm為1.102，裝瓶量為100mL/500mL搖瓶，甲醇體積分數1.0%，每24h補加1次，每隔24h取樣測定凝乳酶比活力，連續誘導168h，結果見圖4。

如圖4所示，重組凝乳酶比活力隨誘導時間的增加酶比活力不斷增大，光密度值也隨之不斷的增大，96h后趨于平穩，光密度值不再變化，凝乳酶比活力仍不斷增大，但增大幅度較小，所以從經濟價值角度考慮，用時短，用料省，產酶活力較高為宜，確定最佳誘導時間為96h。

2.2 酶學性質

2.2.1 凝乳酶的最適溫度

圖5 溫度對凝乳酶活力的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on rennet activity

如圖5所示，凝乳酶的最適反應溫度為60℃；凝乳酶在35～60℃之間，凝乳酶活力隨溫度的升高而增大；當溫度高于70℃時，酶活力明顯下降，到85℃時酶失活。與Megada[10]、Kumar[14]等報道的Bacillus sphaericus和Rhizopus oryzae凝乳酶的最適溫度55℃和60℃相近。

2.2.2 凝乳酶的熱穩定性

圖6 凝乳酶的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of RMPR

如圖6所示，凝乳酶在30～45℃之間有較好的穩定性，此溫度區間保持90min后，相對凝乳酶活力仍在80%以上。但隨著溫度的升高，溫度達到55℃保持20min，凝乳酶活力明顯降低，相對凝乳酶酶活力僅為36.5%，65℃、20min后凝乳酶活力完全喪失。韋薇等[1]報道的小牛凝乳酶55℃保溫90min相對酶活力為36.7%，60℃、60min完全失活。Megada[10]和Kumar[14]等報道的Bacillus sphaericus和Rhizopus oryzae凝乳酶60℃保溫20min，相對酶活力仍為30%和48%。說明RMPR與牛凝乳酶的熱穩定性相當，具有較高的熱不穩定性。

2.2.3 凝乳酶反應最適pH值的確定

圖7 pH值對凝乳酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on RMPR activity

如圖7所示，pH值小于7.0時，凝乳酶活力隨pH值降低而增大，pH5.5時達到最大，pH值大于7.0時酶活力明顯減低，并逐漸失去酶活，與大多數凝乳酶pH值在5.0～7.0之間，隨pH值升高酶活力逐漸降低有所不同。但與Raposo等[13]報道的Centaurea calcitrapa細胞懸液中提取的凝乳酶最適pH值為5.1，pH值低于5.1時，凝乳酶活力有所降低的趨勢相一致。

2.2.4 凝乳酶在不同pH值下的穩定性

圖8 凝乳酶在不同pH值下的穩定性Fig.8 pH stability of RMPR

如圖8所示，凝乳酶在pH5.0～8.0之間相對較穩定，pH6.0時酶活力最穩定，長時間放置后活力沒有任何損失；該酶在pH值小于4的情況下很不穩定，幾乎失去凝乳活力。Kumar等[14]報道的Rhizopus oryzae凝乳酶在pH5.5～7.5之間較穩定，pH7.5凝乳酶剩余活力仍達96%。

2.2.5 底物(復原脫脂乳)質量分數對凝乳酶活力的影響如圖9所示，脫脂乳質量分數為10%時凝乳酶活力最高，隨質量分數升高凝乳酶活力逐漸降低，當復原脫脂乳質量分數為20%時，凝乳酶的相對活力僅為36.5%。Megada[10]、Kumar[14]等曾報道Bacillus sphaericus和Rhizopus oryzae凝乳酶在底物(復原脫脂乳)為8%和9%時，酶活力最高，底物(復原脫脂乳)質量分數逐漸升高凝乳活力略有降低。

表1 金屬離子對凝乳酶活力的影響Table 1 Effects of other metal ions on RMPR activity

圖9 底物質量分數對凝乳酶活力的影響Fig.9 Effect of substrate concentration on RMPR activity

2.2.6 不同CaCl2對凝乳酶活力的影響

圖10 鈣離子濃度對凝乳酶活力的影響Fig.10 Effect of Ca2+concentration on RMPR activity

如圖10所示，酶的凝乳活力隨Ca2+濃度增加而增大，當達到30mmol/L時為最佳濃度，鈣促酶反應達最高值，這一結果與Megada等[10]報道的Bacillus sphaericus凝乳酶最適Ca2+濃度25mmol/L相一致；隨著Ca2+濃度不斷增加凝乳酶活力逐漸降低，但仍然對凝乳酶反應有促進作用，只是促進作用有所降低，Ca2+濃度達到300mmol/L時凝乳酶的相對活力仍為355%(數據未列出)。當Ca2+濃度達到500mmol/L時，凝乳酶相對活力為94.5%，表明過高的Ca2+濃度對凝乳酶有一定的抑制作用。說明Ca2+濃度對凝乳酶有顯著的促進作用。

2.2.7 不同NaCl濃度對酶活力的影響

圖11 NaCl濃度對凝乳酶活力的影響Fig.11 Effect of Na+concentration on RMPR activity

如圖11所示，NaCl在10～300mmol/L范圍內對凝乳酶活力沒有明顯影響，同時都有一定的促進作用。

2.2.8 其他金屬離子對凝乳酶活力的影響

金屬離子是酶反應過程中重要的因子，一些金屬離子對酶反應起到促進作用，一些金屬離子對凝乳酶有抑制作用。從表1可以看出，Ni2+對凝乳酶有較強的抑制作用，Fe3+、Fe2+對凝乳酶的抑制力較弱，Mn2+、Mg2+等離子對該凝乳酶起促進作用，Cu2+對凝乳酶活力沒有影響。

3 結 論

畢赤酵母作為生產外源蛋白的優良宿主已經得到廣泛應用，目前已有400多種蛋白在此體系中得到成功表達，其中包括抗原、抗體、酶、膜蛋白和調節蛋白等。不同蛋白在畢赤酵母中的表達水平有很大區別，同一蛋白在不同發酵條件下的表達水平也有顯著差異。常規發酵條件是滿足一般重組蛋白發酵所需的最基本條件，對表達某個具體的重組蛋白而言不一定是最佳條件，需要作適當調整以最大限度地提高重組蛋白的表達量[15]。本實驗重組微小毛霉凝乳酶在畢赤酵母中表達的最佳時間為96h，最佳裝瓶量為100mL/500mL搖瓶，甲醇誘導體積分數為0.5%，初始光密度值為0.5時為宜。

微小毛霉凝乳酶是酸性蛋白酶，屬天冬氨酸蛋白酶家族，可特異切開κ-酪蛋白Phe105-Met106肽鍵，而具有較高凝乳活性，被廣泛用于乳酪制造業。不同來源的凝乳酶對溫度和pH值穩定性不同，其中以微生物來源的凝乳酶最不敏感，穩定性強。徐速[16]研究表明，凝乳酶的活性在25～70℃之間隨溫度的上升而升高，60℃處理10min酶活損失68%，pH值在2～7之間保持穩定；韋薇等[1]報道的小牛凝乳酶的最適溫度為50℃，60℃保溫10min酶活損失96%；本實驗中RMPR的最適溫度為60℃，60℃保溫10min酶活力損失72%，說明PMPR性質與小牛凝乳酶性質相近，可以作為牛凝乳酶的替代品，應用于干酪生產中。

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Fermentation Conditions for the Production of Recombinant Mucor pusillus Rennet and Its Enzymological Characterization

LI Yu-qiu，WANG Jing-hui，LI Tie-zhu，ZHANG Li，YANG Zhen-nai*
(Center of Agro-Food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China)

The aims of this study were to investigate the fermentation conditions for the production of recombinant Mucor pusillus rennet (RMPR) and to enzymologically characterize the enzyme obtained. An optimum enzyme activity was obtained after 96 h of induction with 1% methanol as the inducer under the following conditions: initial OD600 nm, 0.5; and volume of medium contained in 500 mL flask, 100 mL．The incubation both obtained was centrifugated, and the supernatant was then salted out with ammonium sulfate to prepare crude enzyme solution, and enzymological characterization was carried out for the crude enzyme solution. The optimal reaction temperature of the enzyme was 60 ℃, and it kept stable in the temperature range from 30 to 45 ℃ and the residual enzyme activity was still 86.5% after 90 min of incubation at 45 ℃. As pH increased from 5.5 to 7.0, the activity of the enzyme presented a gradual decrease and the highest enzyme activity was observed at pH 5.5. At a Ca2+concentration of 0.03 mol/L, the enzyme had the highest activity to clot milk, and Na+had no notable effect on the enzyme, and Ni+and Fe2+were both an enzyme inhibitor, while Mn2+, K+and Mg2+all had promoting effect on the enzyme.

Mucor pusillus；rennet；enzymological characterization；fermentation；recombinant

Q814.3

A

1002-6630(2010)19-0225-06

2010-01-09

國家“863”計劃項目(2006AA10Z306)；國家現代農業產業技術體系建設專項(nycytx-0502)

李玉秋(1979—)，女，研究實習員，碩士，研究方向為乳品生物技術。E-mail：lyqhb1@126.com

*通信作者：楊貞耐(1965—)，男，研究員，博士，研究方向為乳品生物技術與乳品工藝。E-mail：zyang@cjaas.com