響應面法優化離子交換法固定化β-D-呋喃果糖苷酶

張媛媛，聶少平，萬 成，謝明勇*

響應面法優化離子交換法固定化β-D-呋喃果糖苷酶

張媛媛，聶少平，萬 成，謝明勇*

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

以大孔陰離子樹脂D311為載體，對日本曲霉來源的β-D-呋喃果糖苷酶進行離子交換法固定化。研究溫度、pH值、時間、游離酶液酶活力對固定化效果的影響，并在此基礎上運用響應面法對固定化條件進行優化。結果表明，最佳固定化條件為：室溫、pH6.6、固定化時間4h、游離酶液酶活力為900U/mL，在此條件下，固定化β-D-呋喃果糖苷酶生產的低聚果糖產量可達58.16%。

β-D-呋喃果糖苷酶；離子交換法；固定化；響應面法

低聚果糖(fructooligosacchrides，FOS)又名蔗果低聚糖具有良好的生理功能[1-2]，特別對改善人體內微生物環境有很大幫助，使人體內有益菌群——雙歧桿菌數量增多，同時抑制有害菌的生長、改善腸道環境、防止便秘[3-5]；除此之外還具有降低血脂和膽固醇、預防齲齒、提高機體免疫力等重要功能。

工業上，主要以蔗糖作底物用微生物酶法生產低聚果糖。一般認為生產低聚果糖是通過β-D-呋喃果糖苷酶催化蔗糖水解并將果糖基轉移到蔗糖分子的果糖殘基位置上而合成的。由于游離酶在工業生產中反應條件較難控制，容易流失，而固定化酶與其相比具有貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續可控、工藝簡便等一系列優點[6-7]。樹脂價格低廉，物化性能穩定，易再生，作為固定化載體有著廣闊的應用前景，并有較為成功的范例[8-9]。離子交換樹脂是一類不溶且具有三維空間網狀骨架結構的親水性功能高分子。連接在樹脂骨架上的功能基，可通過吸附、共價鍵、離子鍵、配位鍵、微膠囊等形式及其他手段將酶固定在樹脂上，構成固定化酶[10]。離子交換法生產的固定化酶具有機械強度高，性質穩定，可以反復再生使用，工作壽命長等優點。

本研究以大孔陰離子樹脂D311為載體，對日本曲霉(Aspergillus japonicus)來源的β-D-呋喃果糖苷酶進行固定化，并采用響應面法對固定化條件進行優化，以期為低聚果糖的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊脂、酵母膏 市售。

蔗糖(Suc，分析純)、NaNO3、K2HPO4、(NH4)SO4、MgSO4·7H2O、乙腈(色譜純) 上海國藥集團化學試劑有限公司；樹脂D311 蘇青水處理工程集團有限公司；低聚果糖標品：蔗果三糖(GF2，純度99.8%)、蔗果四糖(GF3，純度99.8%)、蔗果五糖(GF4，純度86.7%)日本和光純藥工業株式會社。

1.2 儀器與設備

ELSD-UM 3000高效液相色譜儀-蒸發光散射檢測器上海通微科技有限公司；XWK-3A空氣泵 天津市華生分析儀器廠；KQ2200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ZHWY-2102恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；SB-2000水浴鍋 上海愛郎儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；FA1104電子天平 上海精天電子儀器廠。

1.3 菌種與培養基

日本曲霉，實驗室篩選保藏。

查氏培養基：蔗糖30g、瓊脂15g、NaNO33g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g，水1000mL，pH6.0；發酵培養基：蔗糖50g、酵母膏35g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 1g、(NH4)2SO43g，水1000mL，pH6.0。

1.4 方法

1.4.1 β-D-呋喃果糖苷酶游離酶液的制備

取適量日本曲霉菌體，用無菌水配成菌懸液，精確量取3mL菌懸液加入到液體培養基中，30℃振蕩培養48h，搖床轉速120r/min。培養結束后，將發酵液進行細胞破碎，4℃、8000r/min離心10min，取上清液，4℃備用。

1.4.2 離子交換樹脂的預處理

離子交換樹脂先用蒸餾水浸泡脹潤，去雜，然后用4g/100mL NaOH和1.3mol/L HCl溶液交替在磁力攪拌器下攪拌浸泡10h，并分別用蒸餾水沖洗至中性，最后用兩倍體積以上蒸餾水浸泡于4℃冰箱中保存備用[11]。

1.4.3 固定化β-D-呋喃果糖苷酶

以大孔陰離子樹脂D311為固定化載體，取5g處理好的樹脂，放入250mL錐形瓶中，加入25mL游離酶液，放入搖床中，在室溫下，以120r/min的轉速振蕩5h，取出后靜置1h，抽干，用蒸餾水洗滌，直至洗出液中無酶活，即可得到固定化β-D-呋喃果糖苷酶，備用。

1.4.4 響應面試驗設計[12-15]

根據單因素試驗結果，選取對固定化結果影響較大的3個因素，以低聚果糖產量為響應值進行響應面試驗，因素及水平設計見表1。根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，進行三因素三水平的響應面分析試驗，15個試驗點可以分為兩類，其一是析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區域的中心點，零點試驗重復3次，用以估計試驗誤差。

1.4.5 低聚果糖的生產及其測定方法

表1 β-D-呋喃果糖苷酶的固定化條件優化設計表Table 1 Factors and levels in the response surface design

將適量制備的固定化酶加入到用檸檬酸緩沖液(0.1mol/L，pH5.4)配制的50g/100mL蔗糖溶液中，50℃反應1h。反應結束后，煮沸5min，8000r/min離心10min，將上清液過0.45μm濾膜，采用高效液相色譜-蒸發光檢測法對低聚果糖進行檢測，檢測條件為：色譜柱：Waters NH2分析柱(4.6mm×300mm，5μm)，流動相：乙腈(A)、水(B)，梯度洗脫[16]；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；進樣量：10μL；ELSD的漂移管溫度：85℃；載氣：空氣流速2.0L/min。

1.4.6 固定化酶固定化效果測定

采用低聚果糖產率作為衡量固定化酶固定化的效果。

2 結果與分析

2.1 pH值對固定化效果的影響

在pH5.0～7.0、溫度25℃、固定化時間5h、游離酶酶活力800U/mL的條件下，考察pH值對固定化酶固定化效果的影響。結果見圖1。

一般來講，溶液的pH值決定著樹脂交換基團及交換離子的解離程度，它不但影響樹脂的交換容量，而且對交換的選擇性也有很大影響。D311作為弱堿性樹脂，溶液pH值越低，其交換能力越高，所以應在pH≤7.0的溶液中使用，但是對于生物活性分子來說，過強的吸附會增加酶蛋白變性失活的機率，因此溶液的pH值不能太低。由圖1可知，當游離酶液的pH值小于6時，固定化酶活力較低，所以低聚果糖產率較低；當pH值為6左右時，固定化效果較好；隨著pH值增加，樹脂的吸附能力有所下降，固定化效果不佳，導致低聚果糖產率有所降低。

圖1 pH值對固定化酶固定化效果的影響Fig.1 Effect of pH on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase

2.2 固定化時間對固定化效果的影響

在溫度25℃、pH6.5、游離酶酶活力800U/mL的條件下，考察固定化時間分別為2、3、4、5、6h時對固定化酶固定化效果的影響，結果見圖2。

圖2 固定化時間對固定化酶固定化效果的影響Fig.2 Effect of immobilization time on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase

固定化時間對固定化效果和生產周期長短都有很大影響。由圖2可知，固定化時間在2～4h范圍內時，低聚果糖產率隨著時間延長而增大，當時間達到4h后，低聚果糖產率增幅趨于平緩，基本保持穩定，從生產周期角度考慮，固定化時間不宜過長，選取4h左右。

2.3 游離酶液酶活力對固定化效果的影響

在溫度25℃、pH6.5、固定化時間5h的條件下，考察游離酶液酶活力分別為600、700、800、900、1000 U/mL時對固定化酶固定化效果的影響，結果見圖3。

固定化過程中由于受樹脂交換容量的影響，所使用的游離酶液酶活力對固定化結果有很大的影響。若酶液酶活力過低，固定化效果差；若酶活力過高，會造成酶蛋白的浪費，增加成本，故應選擇適宜的游離酶液酶活力。由圖3可知，當游離酶液酶活力較低時，低聚果糖產率隨游離酶液酶活力升高而升高，在900U/mL時達到最大，此后，樹脂交換容量可能達到飽和，再提高游離酶液酶活力，對低聚果糖產率沒有明顯提高。

圖3 游離酶液酶活力對固定化效果的影響Fig.3 Effect of enzyme activity of free β-fructofuranosidase solution on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase

2.4 溫度對固定化效果的影響

在pH6.5，固定化時間5h，游離酶酶活力800U/mL的條件下，考察固定化溫度分別為20、25、30、35℃時對固定化效果的影響，結果見圖4。在30℃時固定化效果較好。因此酶的固定化選擇在30℃條件下進行。

圖4 溫度對固定化效果的影響Fig.4 Effect of immobilization temperature on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase

2.5 響應面試驗分析

2.5.1 響應面試驗結果

表2 響應面試驗設計與分析結果Table 2 Response surface design layout and experimental results

根據表2結果，以低聚果糖產率為響應值(Y)，用SAS統計分析軟件進行多元回歸分析[17-20]，經回歸擬合后，因素對響應值的影響可用回歸方程表示為：

圖5 游離酶液酶活力、時間(X1,X2)交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of enzyme activity of freeβ-fructofuranosidase solution and immobilization time

圖6 游離酶液酶活力、pH值(X1,X3)交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of enzyme activity of freeβ-fructofuranosidase solution and pH

圖7 時間、pH值(X2,X3)交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of pH and immobilization time

表3 回歸方程偏回歸系數的估計值Table 3 Estimated values of partial regression coefficients of the developed regression equation with the yield of fructooligosaccharides using immobilizedβ-fructofuranosidase as a function

表4 回歸方程方差分析表Table 4 Variance analysis for the developed regression equation

根據回歸方程作出響應面圖及等高線圖，由圖5～7可直觀地看出各因子對響應值的影響變化趨勢，而且回歸模型存在最大值。再對回歸方程進行方差分析及偏回歸系數的估計。從表3、4可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系，其因變量和自變量之間的線性關系是顯著的，決定系數為93.51%，說明回歸方程的擬合程度很好，不存在模型擬合不足的現象，因此該響應面能夠真實地反映數據結果。

2.5.2 尋求最優值

利用SAS軟件進行嶺脊分析[21-23]以確定各因素的最佳取值。通過分析可以得到回歸模型的最大值點，該點(X1、X2、X3)的代碼值為(－0.061932、0.093718、0.222773)，與之對應的實際值為X1=893.81U/mL，X2=4.09h，X3=6.61，低聚果糖理論最大產率為58.80%。考慮到實際操作的便利，確定最佳固定化條件：游離酶液酶活力900U/mL、時間4h、pH6.6。

2.5.3 方法重現性實驗

在上述優化條件下共進行3次平行驗證實驗，低聚果糖產率分別為58.69%、57.51%、58.27%，平均產率為58.16%，RSD為1.03%，結果與預測值58.80%是非常接近的。

3 結 論

以大孔徑陰離子樹脂D311為固定化β-D-呋喃果糖苷酶的載體，對其固定化條件進行研究，在單因素試驗基礎上，運用響應曲面分析法對其固定化條件進行優化，從而確定最佳固定化條件為：固定化時間4h、游離酶液酶活力900U/mL、pH值為6.6。在此優化條件下，用固定化β-D-呋喃果糖苷酶進行低聚果糖生產，產率可達到58.16%，經驗證RSD為1.03%，說明該方法準確、穩定、可行。

[1]LOBO A R, FILHO J M, ALVARES E P, et al. Effects of dietary lipid composition and inulin-type fructans on mineral bioavailability in growing rats[J]. Nutrition, 2009, 25(2): 216-225.

[2]張志蘭, 郭杰炎. 蔗果低聚糖合成液的高效液相色譜分析[J]. 分析測試學報, 1997, 16(4): 75-76.

[3]MATUSEK A, MERESZ P, LE T, et al. Effect of temperature and pH on the degradation of fructo-oligosaccharides[J]. Eur Food Res Technol, 2008, 228(3): 355-365.

[4]孔德力, 章學欽. 高純度低聚果糖生產技術的探討[J]. 食品科技, 1999 (3): 27-30.

[5]江波, 王璋. 低聚果糖合成酶: 果糖轉移酶的部分酶學性質研究[J].無錫輕工業大學報, 1995, 14(4): 290-293.

[6]毛跟年, 李麗維, 齊鳳. 固定化酶應用研究進展[J]. 中國釀造, 2009 (8): 17-20.

[7]艾志錄, 江正強, 李里特, 等. 大孔樹脂D380固定化橄欖綠鏈霉菌E-86來源木聚糖酶的研究[J]. 食品與發酵工業, 2004, 30(2): 10-14.

[8]郭紅彥. DEAE-D/H樹脂固定化氨基酰化酶[J]. 化工進展, 2006, 25 (5): 538-541.

[9]張賓. 固定化胰蛋白酶殼聚糖樹脂的制備及其對大豆胰蛋白酶抑制劑的吸附性[J]. 食品工業科技, 2007, 28(7): 65-68.

[10]賈紅華. 聚苯乙烯樹脂固定化D-海因酶的初步研究[J]. 生物加工過程, 2005, 3(2): 41-57.

[11]李再資. 生物化學工程基礎[M]. 北京: 化學工業出版社, 2001.

[12]MAJUMDER A, SINGH A, GOYAL A. Application of response surface methodology for glucan production from Leuconostoc dextranicum and its structural characterization[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 75(1): 150-156.

[13]FARSHID G, HABIBOLLAH Y, SEYED M G, et al. Application of response surface methodology for optimization of cadmium biosorption in an aqueous solution by Saccharomyces cerevisiae[J]. Chemical Engineering Journal, 2008, 145(2): 267-275.

[14]GUO Yuxing, PAN Daodong, TANOKURA M. Optimisation of hydrolysis conditions for the production of the angiotensin-Ⅰ converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from whey protein using response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2009, 114(1): 328-333.

[15]CHEN Xiaochun, BAI Jianxin, CAO Jiaming, et al. Medium optimization for the production of cyclic adenosine 3＇,5＇-monophosphate by Microbacterium sp. no. 205 using response surface methodology[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(2): 919-924.

[16]張媛媛, 聶少平, 萬成, 等. 高效液相色譜-蒸發光散射檢測法同時測定單糖、雙糖及低聚果糖[J]. 食品科學, 2009, 30(18): 237-239.

[17]SU Sainan, NIE Huali, ZHU Limin, et al. Optimization of adsorption conditions of papain on dye affinity membrane using response surface methodology[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(8): 2336-2340.

[18]WANG Jianlong, WAN Wei. Optimization of fermentative hydrogen production process by response surface methodology[J]. International Journal of Hydrogen Energy, 2008, 33(23): 6976-6984.

[19]TATDAO P, DARRYL S, FRANK S. Process optimisation for fractionating Jerusalem artichoke fructans with ethanol using response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2007, 104(1): 73-80.

[20]RAHULAN R, MADHAVAN NAMPOOTHIRI K, SZAKACS G, et al. Statistical optimization of L-leucine amino peptidase production from Streptomyces gedanensis IFO 13427 under submerged fermentation using response surface methodology[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 43(1): 64-71.

[21]SHIH I L, KUO C Y, HSIEH F C, et al. Use of surface response methodology to optimize culture conditions for iturin a production by Bacillus subtilis in solid-state fermentation[J]. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers, 2008, 39(6): 635-643.

[22]DEDAVID E SILVA L A, LOPES F C, SILVEIRA S T, et al. Production of cellulolytic enzymes by Aspergillus phoenicis in grape waste using response surface methodology[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2009, 152 (2): 295-305.

[23]余曉斌, 郝學財. 纖維素酶液體發酵最佳培養基的確定[J]. 工業微生物, 2005, 35(3): 1-5.

Optimization of Ion Exchange Immobilization of β-Fructofuranosidase Using Response Surface Methodology

ZHANG Yuan-yuan，NIE Shao-ping，WAN Cheng，XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

D311 type macroporous anion exchange resin was used as a carrier for the immobilization of β-fructofuranosidase derived from Aspergillus japonicus. The effects of immobilization time and temperature, pH and enzyme activity of free β-fructofuranosidase solution on the catalytic ability of immobilized β-fructofuranosidase were investigated by single factor method and based on this, except immobilization temperature, three other conditions were optimized using response surface methodology. The optimum immobilization conditions were determined as follows: enzyme activity of free β-fructofuranosidase solution 900 U/mL and pH 6.6 for 4 h immobilization at room temperature, and the yield of fructooligosaccharides using immobilized β-fructofuranosidase under these conditions was 58.16%.

β-fructofuranosidase；ion exchange adsorption；immobilization；response surface methodology (RSM)

Q814.2

A

1002-6630(2010)19-0236-05

2010-05-04

教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”項目(IRT0540)；食品科學與技術國家重點實驗室目標導向資助項目(SKLF-MB-200806)

張媛媛(1983—)，女，博士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：zhyy2009@yahoo.com.cn

*通信作者：謝明勇(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品化學、食品營養與安全及天然產物分離與應用。E-mail：myxie@ncu.edu.cn