蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定及其來源分析

易松強，鄭火青，張翠平，魏文挺，胡福良*

蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定及其來源分析

易松強，鄭火青，張翠平，魏文挺，胡福良*

(浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310029)

以對硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物，對蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定條件進行研究。結果表明：蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定的最佳條件為以檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液為提取液，pH5.0，溫度60℃，底物濃度30mmol/L。酶促反應在2.5h和37℃時酶促反應曲線線性關系最好。研究還發現，β-葡萄糖苷酶可能是蜜蜂在采集加工過程中加入進去的，同時，該酶活性還可能與蜂蜜的新鮮度相關。

蜂蜜；β-葡萄糖苷酶；酶活性；來源

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或分泌物，經過充分釀造而貯藏在巢脾內的甜味物質[1]。蜂蜜中含有豐富的生物酶，如淀粉酶、蔗糖轉化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化酶、磷酸酶等[2]。酶對熱穩定性不強，若對蜂蜜長期貯存或進行加工處理，酶的活性會逐步降低。因此，酶值是反應蜂蜜質量的一個重要指標。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidaseEC3.2.1.21)又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，屬于纖維素酶類，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁苷酶，是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶[3]，根據其底物特異性類屬于烴基β-葡萄糖苷酶、纖維二糖酶或水解烴基-β-糖苷基和寡聚糖的酶類。β-葡萄糖苷酶廣泛分布于植物、動物和微生物[4]。

β-葡萄糖苷酶活性的測定主要有以下3種方法[5]：一是Barush和Swiain法，它以水楊苷作底物，酶解產物用4-氨基安替比林作顯色劑，使釋放出來的水楊醇顯色，再用分光光度法比色測定；二是熒光法，利用傘形酮(7-羥基香豆素)與4-甲基傘形酮具強烈熒光的特點，將它們衍生為無熒光的底物，以此測定；三是比色法，以對硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物進行酶解，底物水解后釋放出來的對硝基苯酚在波長400～420nm可見光范圍內有特征吸收峰，可直接在此波長范圍比色測定。

本研究采用比色法測定不同蜂蜜的β-葡萄糖苷酶活性，并對其測定條件進行優化，包括反應底物的濃度、緩沖液pH值、溫度、時間等。同時通過比較油菜花花蜜、蜜蜂體內蜜囊中的蜂蜜和不同成熟度油菜花蜜的β-葡萄糖苷酶活性，分析蜂蜜中該酶的來源以及該酶與蜂蜜新鮮度的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜花花蜜、蜜囊蜜和油菜蜜均于2009年油菜花期采自浙江省平湖市；洋槐蜜和椴樹蜜陳蜜于2008年分別采自遼寧和吉林，由杭州健蜂蜂業有限公司提供。

對硝基苯酚(化學純)；對-硝基苯-β-D-葡萄糖苷Chemsynlab公司；其他試劑均為分析純；所用水均為蒸餾水。

UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油菜花花蜜

在油菜花盛開期，隨機選定幾片油菜田作為實驗區，同時選含苞待放花朵較多的花枝進行套袋處理。在次日上午9:30～11:30用毛細吸管吸取花朵中的花蜜，置于冰浴的0.5mL離心管中，達到一定量后將其密封并貯存于－18℃冰箱中。共收集油菜花花蜜6小管，每小管約0.4mL(約0.5g)，共約2.4mL。每小管用2mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液進行稀釋，檢測β-葡萄糖苷酶活性。1.2.2蜜囊蜜

在蜂箱巢門口，用鑷子夾住一定數量的返巢采集蜂并裝入樣品袋，然后用鑷子將蜜蜂的蜜囊取出，并把蜜囊扯破讓蜜囊中的蜜滴到1.5mL的離心管中，達到一定量后將其密封并放入－18℃冰箱里貯存。共收集蜜囊蜜6小管，每小管1.0mL(約1.4g)，共6.0mL。樣品冷凍于－18℃備用。每小管取1.0g用5mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液進行稀釋，檢測β-葡萄糖苷酶活性。

1.2.3 油菜蜜

在油菜花期間，當日早晨，先將隨機選定的6個實驗強群繼箱中的蜜脾全部搖空，傍晚搖出蜂蜜并分裝到50mL的離心管中，分裝完畢立即置于－18℃冰箱內貯存。以相同方法分別在搖空蜜脾3d和6d后生產更高濃度的油菜蜜。經測定，3種油菜蜜的濃度分別為37、39、41°Be。樣品冷凍于－18℃備用。

1.2.4 白糖蜂蜜

在外界蜜粉源嚴重缺乏的季節，選擇6群強群搖空蜜脾后，早、中、晚各一次飼喂濃糖水，連續飼喂2d，2d后搖出蜂蜜(白糖蜂蜜)。各群蜂蜜樣品分裝后冷凍于－18℃備用。

1.2.5 粗酶液配制

準確稱取1.00g蜂蜜于25mL燒杯中，用少量檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解，然后轉移到10mL容量瓶中，并用上述緩沖液定容。

1.2.6 酶活力的定義

酶活力單位是每分鐘催化形成1μmoL對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位。蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力為每克蜂蜜具有的酶活力單位數。

1.2.7 β-葡萄糖苷酶活性的測定

取0.5mL粗酶液，加入0.5mL不同濃度對硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)。將此反應混合液在不同溫度的水浴鍋內水浴不同時間，待反應結束后，立即加入2.5mL 1mol/L Na2CO3終止液終止反應，冷卻至室溫后在400nm波長處測定吸光度[6]。另外，取相同條件的反應液立即置于沸水浴中加熱5min滅活后加入2.5mL 1mol/L Na2CO3溶液，作為空白對照。

1.2.8 pH值和底物濃度對酶活性的影響

配制不同pH值(pH 4、5、6、7)的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4、5、6、7)，在37℃，底物(pNPG)濃度為10mmol/L，反應1.5 h后，在400nm波長處測定其吸光度。配制不同的底物濃度(10、20、30、40、50mmol/L)，以適合pH值的磷酸鹽緩沖液作為提取液，在37℃水浴中加熱1.5h后，在400nm波長處檢測其吸光度。每組數據3個重復，以平均數計。

1.2.9 溫度和反應時間對酶活性的影響

設pH5.0，反應時間為1.5h，分別測定30、40、50、60、70、80℃時400nm波長處的吸光度，檢測得出該酶最適反應溫度。設pH5.0，反應溫度為30、37、45、50℃且各溫度下反應時間為0、0.5、1、1.5、2、2.5h，檢測酶促反應曲線。每組數據3個重復，取平均值。

2 結果與分析

2.1 緩沖液pH值對酶活性的影響

圖1 緩沖液pH值對酶活性的影響Fig.1 Effect of buffer pH on β-glucosodase activity

由圖1可知，3種蜂蜜都在pH 5.0時吸光度達到最大值，可知測定蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性所用緩沖液以pH 5.0為最佳。

2.2 溫度和反應時間對酶活性的影響

如圖2所示，隨著反應溫度的上升，酶活力顯著增加。但當溫度繼續升高到60℃時，其酶活力逐步降低，表明該酶的最適溫度是60℃。

按1.2.9節方法，測400nm波長處吸光度，由圖3可見，線性回歸方程分別為y = 0.1946x + 0.0373，R2= 0.9746；y = 0.3466x－0.0144，R2= 0.9986；y = 0.3886x + 0.0527，R2= 0.9891；y = 0.4739x + 0.0768，R2= 0.98。從以上數據可知，酶促反應在2.5h內的線性關系中37℃最好，其他相對次之。所以，蜂蜜中β-葡萄糖苷酶酶活性分析條件以37℃最適。

圖2 反應溫度對酶活性的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on β-glucosidase activity

圖3 不同溫度、時間的酶促反應曲線Fig.3 β-glucosidase reaction curves at different temperatures

2.3 不同底物濃度對酶活性的影響

底物濃度是決定酶反應速率的一關鍵因素。在低底物濃度時，反應速率與底物濃度成正比；當底物濃度增大時，隨著底物濃度增加，反應速率亦雖隨之增加，但不會與底物濃度成正比；當底物濃度增加到一定程度后，反應速率不受底物濃度的影響而趨于恒定，這時表明已達到測定酶活性時底物過量的要求。底物濃度對酶活性的影響見圖4。

圖4 不同底物濃度對酶活性的影響Fig.4 Substrate concentration dependence of β-glucosidase activity

由4圖可知，當底物濃度在0～30mmol/L時，隨底物濃度的升高，其產物生成速率也加快；但當底物濃度進一步增加時，產物生成速率不斷減小隨之趨于恒定。因此，測定蜂蜜中β-葡萄糖苷酶酶活性時，其底物濃度應大于30mmol/L。

綜上可知，蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定的最佳條件是：檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液pH5.0，反應溫度為37℃，最適反應溫度為60℃，底物濃度大于30mmol/L，反應時間在2.5h內。

2.4 蜂蜜中β-葡萄糖苷酶的來源

表1 油菜花花蜜和蜜囊蜜中的β-葡萄糖苷酶活力Table 1 β-glucosidase activity of rape honey and honey from bee bag

由表1可知，油菜花花蜜中的β-葡萄糖苷酶活性很低，而蜜囊蜜中的β-葡萄糖苷酶活性相對較高。t檢驗分析結果表明，蜜囊蜜中的β-葡萄糖苷酶活性顯著高于油菜花花蜜中該酶的活性。油菜花花蜜中酶活A400nm值均小于0.100，而儀器測量的準確度為0.100～0.900，所以測量結果誤差大、精確度偏低。

表2 不同濃度梯度油菜蜜的酶活力Table 2 β-glucosidase activity of different concentrations of rape honey

表3 飼喂白糖水蜂群所產蜂蜜的酶活力Table 3 β-glucosidase activity of honey produced by bee population fed white sugar

由表3可看出，喂以白糖水的蜂蜜均檢測出β-葡萄糖苷酶活性，且樣本5的酶活特別高。而在表2中，不同濃度油菜蜜間的β-葡萄糖苷酶活性存在一定的差異。兩兩t檢驗分析結果表明，C組酶活力對A組和B組均差異極顯著，而B組酶活力對A組差異不顯著。

3 討 論

在酶的提取過程中，緩沖液的種類及pH值對提取效果影響非常大。宋曉青等[7]在蠟梅β-葡萄糖苷酶的活性分析、分離純化與性質的研究中，發現當緩沖液pH值為5.0時，各種緩沖液處理的酶活力均達到最高，且檸檬酸-檸檬酸三鈉處理的酶活力高于其他緩沖液。李華等[8]分別用不同緩沖液提取葡萄漿果中β-葡萄糖苷酶時，發現檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液pH6.0時提取效果最好。這表明，β-葡萄糖苷酶的來源不同，其酶性質也存在差異，并且各研究中其酶的優化條件不同，也使優化結果不一致。本實驗用檸檬酸-磷酸氫二鈉提取蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶，對其pH值進行優化。結果表明，最適pH值在5.0左右，比Low等[6]報道的蜂蜜中β-葡萄糖苷酶的最佳pH值為4.2略高，但與Pontoh等[9]研究的從Apis mellifera胃和蜜囊中分離純化到的β-葡萄糖苷酶的最優pH值為5.0相一致。

在其他植物以pNPG為底物檢測β-葡萄糖苷酶活性的研究中，對該酶的優化結果大致是最適pH值為4.5～6.5，最適溫度30～60℃。從大麥[10]分離純化得到的β-葡萄糖苷酶的最適pH值為5.0，這與Sue等[11]研究的結果相一致。但這比香菇(pH4.0)[12]、稻谷(pH 4.5)[13]、大豆(pH4.5)[14]略高，而比柑橘(pH5.5)[15]、玉米(pH5.8)[16]和香子蘭(pH 6.5)[17]要低。從大麥[12]、香菇[13]中分離純化得到的β-葡萄糖苷酶的最適溫度為60℃，這與本研究結果一致。但這比大豆(45℃)[14]、香子蘭(40℃)[17]高。該酶酶促反應曲線的最佳溫度是37℃，這與宋曉青[7]報道的結果相一致。

β-葡萄糖苷酶在植物、動物、真菌和細菌中都有廣泛分布，已報道的β-葡萄糖苷酶的最適pH值大多數在酸性范圍，并且變化不是很大。其最適溫度在40～110℃之間都有分布：一般來說，來自植物的β-葡萄糖苷酶最適溫度在40℃左右，而來自古細菌的β-葡萄糖苷酶其熱穩定性和最適溫度要高于普通微生物或動物來源的β-葡萄糖苷酶[18]。如古細菌Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶其最適溫度為102～105℃[19]。這也說明不同來源的β-葡萄糖苷酶，其性質存在一定差異。

從本實驗研究結果可推測，蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶主要來源于蜜蜂，也就是說蜜蜂在采集加工的過程中添加了這種酶。這與Pontoh等[9]在研究中暗示，β-葡萄糖苷酶可能由蜜蜂的咽下腺產生并分泌到口器而傳遞到外界相吻合。在對蜂群喂以濃白糖水的實驗中，也可以初步確定蜂蜜β-葡萄糖苷酶極有可能是蜜蜂在采集加工過程中添加到蜂蜜中的。而在油菜花花蜜中檢測β-葡萄糖苷酶，發現其活性非常低，這可能是因為人為采集花蜜的過程中混入了一些花粉或其他微生物。但是至于蜜蜂為什么要添加β-葡萄糖苷酶到蜂蜜中，仍然還不清楚。

β-葡萄糖苷酶作為蜂蜜中的一種酶，可能與淀粉酶、轉化酶等有相似的性質，彼此間存在相互關聯，即通過檢測其中一種酶活性時就可以預測另一種酶活性高低[20]。也可能在加工貯藏過程中存在相同的變化趨勢，其酶活力都會有一個下降的過程。但β-葡萄糖苷酶能否作為評價蜂蜜新鮮度的一個指標，有待進一步的研究。

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Determination ofβ-Glucosidase Activity and Source in Honey

YI Song-qiang，ZHENG Huo-qing，ZHANG Cui-ping，WEI Wen-ting，HU Fu-liang*
(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

The determination conditions of β-glucosidase activity in honey were investigated by using p-Nitrophany β-DGluopyranoside (pNPG) as substrate. The optimal reaction pH and temperature of β-glucosidase were 5.0 and 60 ℃, respectively. The enzymatic reaction curve at 37 ℃ and a substrate concentration of 30 mmol/L presented the best linearity. This enzyme may be added into honey during harvest and processing and its activity can be an indicator for the freshness of honey.

honey；β-glucosidase；enzyme activity；source

S896.1

A

1002-6630(2010)19-0241-04

2009-11-21

國家現代農業(蜂)產業技術體系建設專項(NYCYTX-43)

易松強(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為蜜蜂科學。E-mail：yisongqiang87@yahoo.cn

*通信作者：胡福良(1964—)，男，教授，博士，研究方向為蜜蜂科學。E-mail：flhu@zju.edu.cn