曲霉T3-5-1產單寧酶培養條件優化

林健輝，黃曼曼，陳雪香，王 征，肖蘇堯，曹 庸,*

曲霉T3-5-1產單寧酶培養條件優化

林健輝1，黃曼曼1，陳雪香1，王 征2，肖蘇堯1，曹 庸1,*

(1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510640；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

以通過60Co誘變得到的曲霉T3-5-1為實驗菌株，通過單因素與正交試驗，對其產單寧酶的條件進行研究。結果表明：以β-環糊精為碳源、蛋白胨為氮源、培養基初始pH值為5.5、單寧酸質量分數為3.5%、接菌量為5%、搖瓶培養轉速120r/min、250mL三角錐瓶中裝液50mL培養基、培養溫度30℃的培養條件為曲霉T3-5-1的最佳產單寧酶條件。在此條件下，曲霉T3-5-1產單寧酶比活力達到202.16U/mL，比優化前提高約4倍。

曲霉；單寧酶；條件優化

單寧酶(EC3.1.1.20)全稱單寧酰基水解酶(tannin acyl hydrolase)，為胞內酶，在黑曲霉、米曲霉及酵母等微生物中均已經發現，是一種誘導酶[1-6]。單寧酶用途廣泛，既可以水解五倍子單寧生成沒食子酸，也可以催化沒食子酸和丙醇合成沒食子酸丙酯[7]；它還能水解茶葉中的酯型兒茶素制備兒茶素單體。另據報道，單寧酶還可作為食品添加劑和用于開發茶飲料等[8]。在茶飲料生產過程中，主要存在有三大技術難點：渾濁沉淀的產生、湯色的褐變[9]和香氣的惡化。其中，渾濁沉淀的產生是最關鍵的問題所在[10]。在茶飲料生產過程中，由于茶湯中多酚類、咖啡堿、蛋白質等通過分子間氫鍵與疏水作用形成絡合物，可在低溫時沉淀，形成“冷后渾”。沉淀的出現，嚴重影響了茶飲料的感官品質和可溶物總量，因此需要采用物理、化學[11]或酶法來解決。單寧酶作為酶促專溶酶，能斷裂兒茶酚與沒食子酸之間的酯鍵，使苦澀味的酯型兒茶素水解，釋放出的沒食子酸陰離子又能與茶黃素、茶紅素競爭咖啡堿，形成分子質量較小的水溶性短鏈物質，從而降低茶湯的渾濁度[12-13]。

近年來，隨著茶飲料工業的迅猛發展，單寧酶的研究日益受到各國的關注和重視。目前，單寧酶的產量不高，因此，大量的研究工作都是圍繞如何提高單寧酶的產量展開的。本研究以通過60Co誘變得到的曲霉T3-5-1為出發菌，對其產單寧酶的條件進行研究，旨在提高單寧酶的酶活力，為今后制備單寧酶提供更優化的產酶條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

曲霉菌株T3-5-1由華南農業大學食品學院天然活性物研究中心在五倍子中分離并經60Co輻照誘變篩選得到。

1.1.2 試劑

沒食子酸丙酯、單寧酸、蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鐵、硫酸鎂溴酚藍、檸檬酸、檸檬酸鈉均為國產分析純。

1.1.3 培養基

斜面培養基(g/L)：蔗糖30、硝酸鈉3、磷酸氫二鉀1、氯化鉀0.5、硫酸鐵0.01、硫酸鎂0.5；基礎發酵培養基(g/L)：單寧酸20、蔗糖10、硝酸鈉3、磷酸氫二鉀1、氯化鉀0.5、硫酸鐵0.01、硫酸鎂0.5。

1.2 儀器與設備

SE-CJ-27-D超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫搖床 沈陽龍騰電子有限公司；手提式高壓滅菌鍋 濱江醫療設備廠；紫外-可見分光光度計 上海科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 曲霉T3-5-1的搖瓶發酵培養

將曲霉T3-5-1接種于斜面培養基斜面上，30℃培養，待孢子成熟后，用適量的生理鹽水將孢子洗下于裝有玻璃珠的三角錐瓶中，30℃振蕩培養1～2h，使孢子充分分散。取1mL孢子懸液進行梯度稀釋并鏡檢計數[14]，調整孢子密度至106個/mL。

在250mL的錐形瓶中裝入50mL基礎培養基，接種1mL曲霉孢子懸液于30℃，120r/min振蕩培養72h。

1.3.2 單寧酶的提取及酶活力測定[15]

1.3.2.1 粗酶液的提取

發酵懸浮液經濾紙過濾后得到菌絲體。蒸餾水洗至pH值中性，于冰箱中預冷。將菌絲體、石英砂、0.1mol/L pH5.0檸檬酸緩沖液按1:1:4(m/m/V)的比例在冰浴下研磨成漿，0～4℃下10000r/min離心30min。取上清液，用緩沖液定容至10mL，即得單寧酶粗酶液。

1.3.2.2 單寧酶活力的測定

準備1支對照管、1支空白管和3支測定平行管。首先在每支試管中各加入0.2mL酶液，然后在測定管中各加入0.2mL底物沒食子酸丙酯標準溶液(2×10-3mol/L)，在空白管中加入0.2mL 0.1mol/L pH5.0檸檬酸緩沖液，在對照管中加入0.6mL無水乙醇，準確反應20min后，分別在測定管和空白管中加入0.6mL的無水乙醇(終止測定管中的反應)，在對照管中加入0.2mL底物沒食子酸丙酯標準溶液。待反應液冷卻后，再分別在各支試管中加入9mL緩沖液稀釋，測定波長270nm下吸光度。單寧酶酶活力的定義：反應溫度45℃，pH5.0的條件下，酶液每小時水解減少0.01μmol底物沒食子酸定義為一個酶活力單位(U)。

1.3.3 產酶發酵條件的單因素試驗

1.3.3.1 不同質量分數單寧酸對單寧酶比活力的影響

50mL基礎發酵培養基中的單寧酸分別配制成1%、2%、3%、4%、5%，其余組分不變，接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養72h，測定單寧酶比活力。

1.3.3.2 不同種類碳源對單寧酶比活力的影響

50mL基礎發酵培養基中的蔗糖分別替換成等質量分數的葡萄糖、β-環糊精、淀粉、麥芽糖，其余組分不變，接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養72h，測定單寧酶比活力。

1.3.3.3 不同種類氮源對單寧酶比活力的影響

50mL基礎發酵培養基中的硝酸鈉分別替換成等質量濃度的硝酸銨、蛋白胨、豆餅粉、玉米粉，其余組分不變，接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養72h，測定單寧酶比活力。

1.3.3.4 培養基不同初始pH值對單寧酶比活力的影響

50mL基礎發酵培養基的初始pH值分別調成4、5、6、7、8，其余組分不變，接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養72h，測定單寧酶比活力。1.3.3.5不同培養溫度對單寧酶比活力的影響

50mL基礎發酵培養基中接種1mL曲霉孢子懸液，120r/min振蕩培養，分別控制溫度25、28、30、33、35℃，72h后測定單寧酶比活力。

1.3.3.6 不同溶氧量對單寧酶比活力的影響

在菌種搖瓶發酵培養過程中，可通過改變培養基的裝液量和搖床轉速來控制搖瓶中的溶氧量。分別在裝有30、40、50、60、70mL的基礎發酵培養基中接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養72h，測定單寧酶比活力。

裝有50mL的基礎發酵培養基中接種1mL曲霉孢子懸液，30℃搖瓶發酵培養，轉速分別控制在100、120、140、160、180r/min，72h后測定單寧酶比活力。

1.3.3.7 不同接種量對單寧酶比活力的影響

50mL基礎發酵培養基中接種量為3%、4%、5%、6%、7%，30℃、120r/min振蕩培養72h，測定單寧酶比活力。

1.3.4 產酶發酵條件的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇對產酶影響較大的各個因素，進行正交試驗，綜合分析各個因素及其交互作用對產酶發酵的影響，進而確定最優發酵條件。

2 結果與分析

2.1 不同單寧酸質量分數對單寧酶比活力的影響

圖1 不同單寧酸質量分數對曲霉T3-5-1產單寧酶的影響Fig.1 Effect of tannic acid concentration on tannase production

單寧酶是誘導酶，因此在產單寧酶發酵培養基中必須加入適當的誘導物單寧酸。由圖1可知，當誘導物單寧酸的質量分數為3%時，單寧酶活力最大，為62.33U/mL。

2.2 碳源對單寧酶比活力的影響

圖2 不同碳源對曲霉T3-5-1產單寧酶的影響Fig.2 Effect of carbon source type on tannase production

如圖2所示，β-環糊精作為碳源可使酶比活力達到最大值116.51U/mL。其他4種碳水化合物所對應的酶活力均低于此最大酶比活力，使用蔗糖作為碳源的基礎培養基使酶比活力達到50.24U/mL。

2.3 氮源對單寧酶比活力的影響

圖3 不同氮源對曲霉T3-5-1產單寧酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source type on tannase production

如圖3所示，與硝酸鈉作為氮源相比，無機氮源中硝酸銨表現出較低的單寧酶比活力(31.65U/mL)；有機氮源中，蛋白胨表現的單寧酶比活力則顯著提高(80.98U/mL)。

2.4 初始pH值對單寧酶比活力的影響

圖4 初始pH值對曲霉T3-5-1產單寧酶的影響Fig.4 Effect of medium initial pH on tannase production

如圖4所示，培養基初始pH6時，酶比活力可達到最大值47.65U/mL。當初始pH值過高(pH7～8)時，菌株產酶能力則受到比較大的抑制。

2.5 培養溫度對單寧酶比活力的影響

圖5 不同培養溫度對曲霉T3-5-1產單寧酶的影響Fig.5 Effect of culture temperature on tannase production

溫度對發酵產酶過程的影響主要表現在對菌絲生長和代謝途徑中各種酶活性的影響。如圖5所示，當溫度控制在30℃時，酶比活力達最大值46.54U/mL。

2.6 溶氧量對單寧酶比活力的影響

圖6 不同裝液量對曲霉T3-5-1產單寧酶的影響Fig.6 Effect of medium volume contained in 250 mL shaking flask on tannase production

如圖6所示，當轉速(120r/min)恒定，250mL三角瓶裝液量為50mL時，單寧酶比活力最大值可達45.50U/mL；如圖7所示，當裝液量(50mL)恒定，轉速在120r/min時，獲得酶比活力最大值47.03U/mL。

圖7 不同搖床轉速對曲霉T3-5-1產單寧酶的影響Fig.7 Effect of rotational speed of shaking flask on tannase production

2.7 不同接種量對單寧酶比活力的影響

圖8 不同接種量對曲霉T3-5-1產單寧酶的影響Fig.8 Effect of inoculum size on tannase production

如圖8所示，當接種量達到5%時，單寧酶比活力達到最大，為97.32U/mL。

2.8 曲霉產酶條件優化的正交試驗

表1 各單因素方差分析Table 1 Analysis of variances for tannase production with eight different culture conditions

對各單因素試驗進行方差分析，結果如表1所示，單寧酸質量分數、碳源、氮源、初始pH值、以及接種量這5個因素對曲霉T3-5-1產單寧酶活力具有極顯著影響，因此選擇這5個因素，每個因素選擇4個水平進行L16(45)正交試驗。正交表設計見表2。

表2 L16(45)正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design

表3 產酶發酵條件的正交試驗結果Table 3 Orthogonal array design layout and experimental results

由表3所示，5個因素影響曲霉T3-5-1產單寧酶能力的主次順序為碳源＞氮源＞單寧酸質量分數＞pH值＞接種量，最優正交組合為A2B2C3D2E3，即以蛋白胨為氮源、以β-環糊精為碳源、培養基初始pH5.5、單寧酸質量分數為3.5%、接種量為5%。

2.9 驗證實驗

碳源為β-環糊精、氮源為蛋白胨、培養基初始pH 5.5、單寧酸質量分數為3.5%、接種量為5%，搖瓶培養轉速120r/min，250mL三角錐瓶中裝液50mL培養基，培養溫度30℃，在此條件下，曲霉T3-5-1產單寧酶比活力達到202.16U/mL。

3 結 論

本實驗室從植物五倍子中分離出一株產單寧酶的曲霉，然后利用60Co輻照誘變得到一株高產單寧酶菌株T3-5-1。通過單因素試驗和L16(45)正交試驗對其產酶條件進行優化，結果表明，單寧酶的誘導物單寧酸的質量分數、接種量、培養基初始pH值對菌株產單寧酶活力有很大影響。而溶氧量對菌株產酶活力的影響并不大；此外溫度的影響也不大。菌株T3-5-1利用的碳源、氮源比較廣泛，其中碳源以β-環糊精最好，氮源以蛋白胨最佳。參考有關單寧酶產酶條件的研究[14-15]發現曲霉基本上都傾向于使用植物氮源豆餅粉，但本實驗中的曲霉T3-5-1卻傾向于使用動物性氮源蛋白胨，這與前人的研究結果有所不同；而在碳源的使用上，曲霉T3-5-1傾向于利用可溶性淀粉β-環糊精，也與前人的研究結果不同，這說明不同來源的曲霉，其最優產酶條件并不完全一樣。因此對此誘變菌株T3-5-1進行菌種鑒定，以及對其所產的單寧酶進行分離純化及酶學性質研究，比較其與傳統單寧酶是否存在差異，是下一步研究的方向。通過培養條件優化，單寧酶比活力達到202.16U/mL，比優化前提高約4倍。

[1]IIBUCHI S, MINODA Y, YAMADA K. Studies on tannin acyl hydrolase of microorganisms. Part III. Purification of the enzyme and some properties of it[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1968, 32(7): 803-809.

[2]IIBUCHI S, MINODA Y, YAMADA K. Hydrolyzing pathway substrate specificity and inhibition of tannin acyl hydrolase of Asp.oryzone No.7 [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1972, 36(9): 1553-1562.

[3]BARTHOMEUF C, REGERAT F, POURRAT H. Improvement in tannase recovery using enzymatic disruption of mycelium in combination with reverse micellar enzyme extraction[J]. Biotechnology Techniques, 1994, 18(2): 137-142.

[4]FARIAS G M, GORBEA C, EKINS J R, et al. Purification characterization and substrate relationships of the tannase from Cryphonectria parasitica[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1994, 44 (1): 51-63.

[5]ADACHI O, WATANABLE M, YAMADA H. Studies on fungal tannase. Part II. Physicochemical properties of tannase of Aspergillus flavus[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1968, 32(9): 1079-1085.

[6]YAMADA H, ADACHI O, WATANABE M, et al. Formation, purification, and catalytic properties of tannase of Aspergillus flavus[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1968, 32(9): 1074-1078.

[7]刁其玉. 單寧的最新研究動態[J]. 飼料研究, 1999 (11): 126-129.

[8]瞿燕. 五倍子發酵工藝及藥理實驗研究[D]. 成都: 成都中醫藥大學, 2002: 8-9.

[9]嚴鴻德. 茶葉深加工技術[M]. 北京:中國輕工業出版社, 1998: 30-31.

[10]張正竹. 談紅茶茶湯沉淀物的轉溶[J]. 中國茶葉, 1996 (2): 34-35.

[11]王元鳳, 王登良, 魏新林. 酶技術在茶葉深加工中的應用研究[J]. 飲料工業, 2000, 3(6): 18-22.

[12]方元超, 趙晉府. 茶飲料生產技術[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2001: 26-27.

[13]閻守和. 速溶茶生物化學[M]. 北京: 北京大學出版社, 1990: 97-119.

[14]郭魯宏, 楊順楷. 單寧酶產生菌的篩選和發酵條件的研究[J]. 應用與環境生物學報, 1998, 4(4): 386-389.

[15]王征, 謝達平, 楊虹琦, 等. 單寧酶活力測定方法的研究[J]. 生物技術, 2000, 10(6): 40-42.

Optimization of Culture Conditions for Producing Tannase by Aspergillus sp.T3-5-1

LIN Jian-hui1，HUANG Man-man1，CHEN Xue-xiang1，WANG Zheng2，XIAO Su-yao1，CAO Yong1,*
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510640, China；2. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The conditions for producing tannase by a strain of Aspergillus sp.T3-5-1, which was derived from60Co-induced mutation, were optimized using single factor and orthogonal array design methods. The optimal carbon source, nitrogen source, medium initial pH, tannic acid concentration, inocumlum size, rotational speed of shaking flask, medium volume contained in 250 mL shaking flask and culture temperature were β-cyclodextrin, peptone, 5.5, 3.5%, 5%, 120 r/min, 50 mL /250 mL and 30 ℃, respectively. The maximum tannase activity was up to 202.16 U/mL under these conditions, approximately 4-fold higher than before optimization.

Aspergillus；tannase；optimization of culture conditions

TQ925

A

1002-6630(2010)19-0245-05

2009-12-23

林健輝(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：jianhuilcn@126.com

*通信作者：曹庸(1966—)，男，教授，博士，研究方向為天然活性物的提取、分離純化。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn