裂殖壺菌鯊烯合酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達

朱路英，朱清華，張學成*

裂殖壺菌鯊烯合酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達

朱路英1,2，朱清華3,2，張學成2,*

(1.魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025；2.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；3.德州學院生物系，山東 德州 253023)

為探討裂殖壺菌烯合酶基因的克隆，以及在大腸桿菌中的表達。采用簡并引物與RACE相結合的方法從裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)中克隆出鯊烯合酶基因。分析表明該基因的cDNA全長包括1672個核苷酸，編碼一個含446個氨基酸的開放閱讀框；在裂殖壺菌中以單拷貝的形式存在。同源分析顯示裂殖壺菌鯊烯合酶的氨基酸序列中含有5個保守基序。將裂殖壺菌鯊烯合酶的cDNA序列連接到原核表達載體pGEX-4T-3上構建融合表達載體，并在大腸桿菌BL21中進行IPTG誘導表達，SDS-PAGE及Western blotting分析結果顯示，誘導表達出的融合蛋白主要以包涵體的形式存在，其相對分子質量與預期相符；且融合蛋白具有一定的免疫原性。

裂殖壺菌；鯊烯合酶；cDNA克??；原核表達

鯊烯合酶(squalene synthase，SQS，EC 2.5.1.21)是生物體合成鯊烯的關鍵酶，催化兩分子的法尼基二磷酸縮合產生鯊烯，鯊烯通常再由2,3-氧化鯊烯環化酶催化生成2,3-環氧化鯊烯，然后再進入不同的分枝途徑最終生成甾醇或其他三萜化合物[1]。SQS是類異戊二烯途徑中合成甾醇類化合物的一種關鍵的分枝酶，因此，被認為是一種可以控制甾醇類化合物合成的調控位點，從而吸引研究者的興趣。對鯊烯合酶基因的研究已有一些報道[2-7]，但主要局限在幾種模式生物及藥用植物上；而對微生物，特別是海洋微生物鯊烯合酶基因的研究還不多見。裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)是一類富含DHA的海洋真菌，有研究發現，在某些種的裂殖壺菌體內還存在一定數量的角鯊烯和類胡蘿卜素[8]，這一研究結果進一步提高了裂殖壺菌的開發應用價值。到目前為止，尚未見殖壺菌鯊烯合酶基因的報導。本研究通過簡并引物及RACE法克隆裂殖壺菌鯊烯合酶基因的cDNA序列，并對其在大腸桿菌中的表達進行研究，以期為進一步研究該基因在微生物甾醇合成調控中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

裂殖壺菌菌株OUC88、大腸桿菌JM109、表達宿主菌BL21 本實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

限制性內切酶、DNA連接試劑盒、pMD18-T Takara公司；Taq酶、DNA通用純化試劑盒、RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒 Sangon公司；SMART RACE克隆試劑盒 Clotech公司；pGEX-4T-3 Amersham Pharmacia Biotech公司；DIG-High Prime Kit、DIG Nucleic Acid Detection Kit Roche公司。

K640基因擴增儀 杭州晶格科學儀器有限公司；S.SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海躍進醫療器械廠；HZ100型恒溫搖床 武漢瑞華儀器設備有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

取培養2d的裂殖壺菌菌體適量，液氮研磨后加入Trizol，用針筒勻漿，再加入氯仿劇烈振蕩，4℃、8000r/min離心5min后取上清加入無水乙醇，混勻后轉入UNIQ-10柱中，離心棄廢液后，用RPE溶液洗柱兩次，最后加入DEPC-H2O將吸附于柱上的RNA洗脫，電泳分析RNA質量。

取總RNA 5μg和Oligo-dT引物混合在cDNA合成Buffer中，70℃變性5min后，加入dNTP和RNA反轉錄酶，然后37℃溫育1h，這樣得到cDNA第一鏈作為模板，進行PCR反應。

1.4 引物設計與RT-PCR

根據已發表的人、酵母等物種的SQS基因序列，設計一對簡并引物，序列如下：P1：5＇-TA(T/C)TG(T/C) CA(T/C)TA(T/C)GT(T/C/A/G)GC-3＇；P2：5＇-AC(T/C)TG (G/A/T/C)GG(G/A/T)AT(G/A/T/C)GC(G/A)CA(G/A)AA-3＇。

利用CLOTECH SMART RACE克隆試劑盒，通過5＇-RACE和3＇-RACE來獲得裂殖壺菌SQS cDNA序列的兩個末端，應用的特異序列PCR引物如下：正義引物：5＇-TACTGCCCTGCTGACCTTGTGA-3＇；反義引物：5＇-GGAAAGCGAACAGACAGGGTG-3＇。

1.5 Southern雜交分析SQS基因的拷貝數

采用CTAB法提取裂殖壺菌基因組DNA，分別用EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ和XbaⅠ酶切20μg裂殖壺菌基因組DNA，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜上；按照DIG-High Prime Kit操作說明書標記SQS cDNA的402bp片段為探針；Southern雜交和顯色按照DIG Nucleic Acid Detection Kit 進行。

1.6 裂殖壺菌SQS與同族其他蛋白的比對和進化分析

采用CLUSTALX和PHYLIP軟件對裂殖壺菌SQS cDNA進行序列比對和進化分析。

1.7 原核表達載體的構建

根據已測序確定的裂殖壺菌SQS cDNA進行引物設計，擴增出SQS的編碼區全長序列，純化后連接到融合表達載體pGEX-4T-3的多克隆位點上，構建融合表達載體pGEX-SQS；轉化感受態大腸桿菌BL21，PCR篩選重組子，測序鑒定插入DNA片段的基因序列及插入方向。

1.8 融合蛋白的誘導表達和SDS-PAGE電泳分析

含裂殖壺菌SQS cDNA重組質粒的BL21菌株接種于含有氨芐青霉素的培養基中，37℃振蕩培養過夜，次日按1:100擴大培養至OD600nm值為0.5，加入IPTG至終濃度為2.0mmol/L繼續培養3～4h。離心收集細菌，按薩姆布魯克等[9]的方法進行SDS-PAGE電泳檢測表達情況。

1.9 表達產物的Western blotting分析

按照GST標簽純化樹脂說明書中的方法，將表達的重組蛋白進行純化，按文獻[10-11]制備多克隆抗體。取適量經IPTG誘導表達的pGEX-SQS菌體，進行SDS-PAGE蛋白電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，用5g/100mL脫脂奶粉封閉過夜。用制備的多克隆抗體做一抗，室溫作用1h，PBS洗滌兩次；以HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫作用1h，PBS洗滌兩次，以DAB顯色，觀察表達產物。

2 結果與分析

2.1 裂殖壺菌SQS基因全長cDNA序列的克隆

圖1 裂殖壺菌鯊烯合酶基因全長cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of S.limacinum SQS cDNA

利用簡并引物從裂殖壺菌的cDNA中擴增出來一條約400bp的片段，把它連接到pMD18-T載體上進行測序。測序結果通過BLAST比對分析表明，該序列和酵母、煙草、人等生物的SQS序列有較高的同源性，說明它是裂殖壺菌SQS cDNA的一段序列。根據它的核苷酸序列設計出一對特異性引物，利用CLOTECH SMART RACE克隆系統，得到一段cDNA序列的5＇末端和3＇末端，從而拼接出全長的cDNA序列。這一序列全長為1672bp，其中，閱讀框1338bp，編碼446個氨基酸，其5＇端和3＇端分別有一個含35個堿基和299個堿基組成的非編碼區，3＇末端有真核生物典型的polyA加尾結構，說明它的序列是完整的(圖1)，其中GenBank登錄號為DQ464066，推導的其蛋白質分子質量為47.1kD。

2.2 SQS基因的Southern雜交分析

圖2 SQS基因在裂殖壺菌基因組中的Southern雜交結果Fig.2 Southern blot analysis of S.limacinum SQS gene

圖3 裂殖壺菌SQS與其他物種SQS的氨基酸序列比對Fig.3 SQS gene-encoded amino acid sequence alignment between Schizochytrium limacinum and other species

分別用EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ和XbaⅠ酶切20μg裂殖壺菌基因組DNA，以SQS cDNA的402bp特異片段為探針，進行Southern雜交，結果均出現單一條帶(圖2)，表明該基因在裂殖壺菌基因組中以單拷貝形式存在。

另外，在開放閱讀框的兩端(包括整個ORF)設計一對特異引物，以裂殖壺菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到一條約1.3kb的片段，回收后連接到T載體上進行測序，發現該序列與SQS的cDNA序列完全一致，說明得到的裂殖壺菌鯊烯合酶基因序列中不含內含子。

2.3 同源性分析

用軟件Blastp分析發現，推導的SQS的氨基酸序列與其他已知的SQS序列具有一定的同源性和相似性，但同源性較低，與煙草、酵母、鼠和人SQS序列的同源性分別為38%、37%、40%和39%。與已知的SQS序列相比，裂殖壺菌SQS在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ區顯示出了SQS家族氨基酸序列的保守性(圖3)，在Ⅱ區存在典型的DXXXDD基序，Ⅳ區有保守的DXXED基序，確認了該序列是SQS家族成員。

2.4 進化分析

圖4 鯊烯合酶系統進化分析Fig.4 Phylogenetic tree based on SQS gene-encoded amino acid sequence

運用CLUSTL W程序對裂殖壺菌鯊烯合酶和其他已知的鯊烯合酶氨基酸序列進行系統進化分析，結果如圖4所示。裂殖壺菌的鯊烯合酶基因氨基酸序列并沒有與酵母等真菌類的鯊烯合酶基因氨基酸序列聚類，而是先與伊氏錐蟲、布朗葡萄藻及幾種植物的鯊烯合酶基因氨基酸序列聚類，其次再與動物的鯊烯合酶基因氨基酸序列聚類，然后才與酵母等真菌類微生物聚類。這說明裂殖壺菌的鯊烯合酶基因與植物的鯊烯合酶基因在進化源祖上較接近，而真菌中鯊烯合酶基因呈多元分化。2.5目的融合蛋白的表達

在裂殖壺菌SQS基因的開放閱讀框兩側設計一對特異引物，分別加上EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位點，以裂殖壺菌cDNA為模板，進行PCR擴增。將測序正確的PCR擴增產物定向連接到融合表達載體pGEX-4T-3多克隆位點EcoRⅠ和NotⅠ之間，轉化大腸桿菌BL21，用PCR法篩選重組子，經測序鑒定，得到融合表達重組體pGEX-SQS。

收集經IPTG誘導的重組菌體，經超聲破壁后，進行SDS-PAGE分析，結果表明在分子質量73kD(pGEX-4T-3中的谷胱甘肽S-轉移酶26kD與目的蛋白SQS 47.1kD融合)左右處有一條明顯的蛋白條帶(圖中箭頭標示)，同預計的大小一致，而空載體及未經IPTG誘導的重組體則沒有明顯的該條帶，表明pGEX-SQS重組質粒在宿主菌BL21中經IPTG誘導能表達融合蛋白。通過比較重組菌體經超聲波破碎后的沉淀和上清液的蛋白表達譜，可以看出目的蛋白主要以包涵體的形式存在于破壁沉淀中。

圖5 SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白在E. coli中的表達Fig.5 SDS-PAGE profile of recombinant protein

2.6 表達產物的Western blotting檢測

圖6 重組蛋白的Western blotting分析Fig.6 Western blotting Identification of recombinant protein

為了驗證表達蛋白的正確性，將融合蛋白經GST標簽純化樹脂進行純化，純化后的融合蛋白進行Westernblotting檢測。結果顯示，融合蛋白能特異性地與所制備的多克隆抗體進行抗血清反應，在分子質量約73kD處出現了一條特異反應帶，攜帶空載體的菌株蛋白樣品結果為陰性(圖6)，進一步證實了所表達蛋白的正確性并表明其具有免疫原性。

3 討 論

目前，已有十幾個物種的SQS基因被克隆出來，其拷貝數在不同的物種中有所不同。其中，人和酵母的SQS基因都以單拷貝的形式存在[12-13]，而辣椒和綠藻Botryococcus braunii等物種的SQS基因至少為兩個拷貝[2-3]。本研究發現裂殖壺菌的SQS基因以單拷貝的形式存在，且不含內含子。這說明SQS基因具有多樣性。SQS基因的另一個特點是植物、動物和真菌之間的SQS氨基酸序列相似性比較低，同源性在35%～40%之間，但在植物之間(煙草與擬南芥)、動物之間(人與鼠)相似性較高，而真菌中呈多元分化的趨勢[14]。研究表明裂殖壺菌的SQS基因的氨基酸序列與煙草、酵母、鼠和人SQS序列的同源性分別為38%、37%、40%和39%，均不是很高，這與前人的研究結果一致[14]。比較不同物種的SQS氨基酸序列，發現有6個比較保守的區域，其中區域Ⅰ保守性較差，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ區高度保守，這4個區域被認為與該酶的催化活性相關[15]。其中，Ⅱ區和IV區分別存在著富含天冬氨酸殘基的序列DXXEDD和DXXED，這兩個區被認為是底物法尼基二磷酸的結合位點[16]；Ⅲ區和Ⅴ區被認為是酶活性中心的催化位點，位點突變分析證實Ⅲ區中保守的酪氨酸(Tyr)和Ⅴ區中的苯丙氨酸(Phe)和谷氨酸(Glu)對保持SQS酶活性具有關鍵作用[17]。Ⅵ區(C末端區)的保守性最低，但含有一個高度疏水序列，被認為與酶和內質網膜的結合有關，可能是鯊烯合酶的一個膜靶位點和錨定信號[2,17]。本研究發現，裂殖壺菌的SQS氨基酸序列也含有這6個保守區域，其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ區保守性較高，而且在Ⅱ區和Ⅳ區也分別存在著典型的DXXXDD和DXXED基序；Ⅵ區的保守性很低，但仍為一個疏水區域。這些結果與相關文獻相符。

總之，本研究通過簡并引物與RACE相結合的方法克隆出了裂殖壺菌鯊烯合酶基因的全長cDNA片段，同源性分析發現它是SQS基因家族的新成員；并對其編碼區進行了原核表達，為下一步的功能分析以及進一步研究該基因在裂殖壺菌甾醇合成調控中的具體作用提供資料。

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Cloning and Prokaryotic Expression of Squalene Synthase Gene from Schizochytrium limacinum

ZHU Lu-ying1,2，ZHU Qing-hua3,2，ZHANG Xue-cheng2,*
(1. School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China；2. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China,Qingdao 266003, China；3. Department of Biology, Dezhou College, Dezhou 253023, China)

A full length cDNA of squalene synthase (SQS) gene was isolated from Schizochytrium limacinum using homologybased cloning and RACE methods. Molecular biological analysis showed that the full length cDNA was of 1672 bp, with a 1338 bp open reading frame encoding 446 amino acids, and the SQS gene was a single copy gene in Schizochytrium limacinum. Homology analysis showed that Schizochytrium limacinum SQS cDNA had five consensus regions. The SQS cDNA was constructed into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-3 and expressed in E.coli BL21. SDS-PAGE and Western blotting analyses showed that the recombinant protein was mainly in the form of inclusion body, of which molecular weight was as expected, and had good immunogenicity.

Schizochytrium limacinum；squalene synthase；cDNA cloning；prokaryotic expression

Q786

A

1002-6630(2010)19-0263-05

2010-06-27

魯東大學校基金項目(LY20063307)；魯東大學學科建設經費資助項目

朱路英(1974—)，女，講師，博士，研究方向為生物化學。E-mail：lyzhu@126.com

*通信作者：張學成(1939—)，男，教授，碩士，研究方向為海洋生物學。E-mail：xczhang@ouc.edu.cn