裂殖壺菌鯊烯合酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)

朱路英，朱清華，張學(xué)成*

裂殖壺菌鯊烯合酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)

朱路英1,2，朱清華3,2，張學(xué)成2,*

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3.德州學(xué)院生物系，山東 德州 253023)

為探討裂殖壺菌烯合酶基因的克隆，以及在大腸桿菌中的表達(dá)。采用簡并引物與RACE相結(jié)合的方法從裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)中克隆出鯊烯合酶基因。分析表明該基因的cDNA全長包括1672個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)含446個(gè)氨基酸的開放閱讀框；在裂殖壺菌中以單拷貝的形式存在。同源分析顯示裂殖壺菌鯊烯合酶的氨基酸序列中含有5個(gè)保守基序。將裂殖壺菌鯊烯合酶的cDNA序列連接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-3上構(gòu)建融合表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE及Western blotting分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達(dá)出的融合蛋白主要以包涵體的形式存在，其相對分子質(zhì)量與預(yù)期相符；且融合蛋白具有一定的免疫原性。

裂殖壺菌；鯊烯合酶；cDNA克隆；原核表達(dá)

鯊烯合酶(squalene synthase，SQS，EC 2.5.1.21)是生物體合成鯊烯的關(guān)鍵酶，催化兩分子的法尼基二磷酸縮合產(chǎn)生鯊烯，鯊烯通常再由2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶催化生成2,3-環(huán)氧化鯊烯，然后再進(jìn)入不同的分枝途徑最終生成甾醇或其他三萜化合物[1]。SQS是類異戊二烯途徑中合成甾醇類化合物的一種關(guān)鍵的分枝酶，因此，被認(rèn)為是一種可以控制甾醇類化合物合成的調(diào)控位點(diǎn)，從而吸引研究者的興趣。對鯊烯合酶基因的研究已有一些報(bào)道[2-7]，但主要局限在幾種模式生物及藥用植物上；而對微生物，特別是海洋微生物鯊烯合酶基因的研究還不多見。裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)是一類富含DHA的海洋真菌，有研究發(fā)現(xiàn)，在某些種的裂殖壺菌體內(nèi)還存在一定數(shù)量的角鯊烯和類胡蘿卜素[8]，這一研究結(jié)果進(jìn)一步提高了裂殖壺菌的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。到目前為止，尚未見殖壺菌鯊烯合酶基因的報(bào)導(dǎo)。本研究通過簡并引物及RACE法克隆裂殖壺菌鯊烯合酶基因的cDNA序列，并對其在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步研究該基因在微生物甾醇合成調(diào)控中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

裂殖壺菌菌株OUC88、大腸桿菌JM109、表達(dá)宿主菌BL21 本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶、DNA連接試劑盒、pMD18-T Takara公司；Taq酶、DNA通用純化試劑盒、RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 Sangon公司；SMART RACE克隆試劑盒 Clotech公司；pGEX-4T-3 Amersham Pharmacia Biotech公司；DIG-High Prime Kit、DIG Nucleic Acid Detection Kit Roche公司。

K640基因擴(kuò)增儀 杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；S.SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HZ100型恒溫?fù)u床 武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

取培養(yǎng)2d的裂殖壺菌菌體適量，液氮研磨后加入Trizol，用針筒勻漿，再加入氯仿劇烈振蕩，4℃、8000r/min離心5min后取上清加入無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ-10柱中，離心棄廢液后，用RPE溶液洗柱兩次，最后加入DEPC-H2O將吸附于柱上的RNA洗脫，電泳分析RNA質(zhì)量。

取總RNA 5μg和Oligo-dT引物混合在cDNA合成Buffer中，70℃變性5min后，加入dNTP和RNA反轉(zhuǎn)錄酶，然后37℃溫育1h，這樣得到cDNA第一鏈作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與RT-PCR

根據(jù)已發(fā)表的人、酵母等物種的SQS基因序列，設(shè)計(jì)一對簡并引物，序列如下：P1：5＇-TA(T/C)TG(T/C) CA(T/C)TA(T/C)GT(T/C/A/G)GC-3＇；P2：5＇-AC(T/C)TG (G/A/T/C)GG(G/A/T)AT(G/A/T/C)GC(G/A)CA(G/A)AA-3＇。

利用CLOTECH SMART RACE克隆試劑盒，通過5＇-RACE和3＇-RACE來獲得裂殖壺菌SQS cDNA序列的兩個(gè)末端，應(yīng)用的特異序列PCR引物如下：正義引物：5＇-TACTGCCCTGCTGACCTTGTGA-3＇；反義引物：5＇-GGAAAGCGAACAGACAGGGTG-3＇。

1.5 Southern雜交分析SQS基因的拷貝數(shù)

采用CTAB法提取裂殖壺菌基因組DNA，分別用EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ和XbaⅠ酶切20μg裂殖壺菌基因組DNA，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；按照DIG-High Prime Kit操作說明書標(biāo)記SQS cDNA的402bp片段為探針；Southern雜交和顯色按照DIG Nucleic Acid Detection Kit 進(jìn)行。

1.6 裂殖壺菌SQS與同族其他蛋白的比對和進(jìn)化分析

采用CLUSTALX和PHYLIP軟件對裂殖壺菌SQS cDNA進(jìn)行序列比對和進(jìn)化分析。

1.7 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已測序確定的裂殖壺菌SQS cDNA進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增出SQS的編碼區(qū)全長序列，純化后連接到融合表達(dá)載體pGEX-4T-3的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-SQS；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，PCR篩選重組子，測序鑒定插入DNA片段的基因序列及插入方向。

1.8 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE電泳分析

含裂殖壺菌SQS cDNA重組質(zhì)粒的BL21菌株接種于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1:100擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600nm值為0.5，加入IPTG至終濃度為2.0mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)3～4h。離心收集細(xì)菌，按薩姆布魯克等[9]的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)情況。

1.9 表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting分析

按照GST標(biāo)簽純化樹脂說明書中的方法，將表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，按文獻(xiàn)[10-11]制備多克隆抗體。取適量經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的pGEX-SQS菌體，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5g/100mL脫脂奶粉封閉過夜。用制備的多克隆抗體做一抗，室溫作用1h，PBS洗滌兩次；以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫作用1h，PBS洗滌兩次，以DAB顯色，觀察表達(dá)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖壺菌SQS基因全長cDNA序列的克隆

圖1 裂殖壺菌鯊烯合酶基因全長cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of S.limacinum SQS cDNA

利用簡并引物從裂殖壺菌的cDNA中擴(kuò)增出來一條約400bp的片段，把它連接到pMD18-T載體上進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過BLAST比對分析表明，該序列和酵母、煙草、人等生物的SQS序列有較高的同源性，說明它是裂殖壺菌SQS cDNA的一段序列。根據(jù)它的核苷酸序列設(shè)計(jì)出一對特異性引物，利用CLOTECH SMART RACE克隆系統(tǒng)，得到一段cDNA序列的5＇末端和3＇末端，從而拼接出全長的cDNA序列。這一序列全長為1672bp，其中，閱讀框1338bp，編碼446個(gè)氨基酸，其5＇端和3＇端分別有一個(gè)含35個(gè)堿基和299個(gè)堿基組成的非編碼區(qū)，3＇末端有真核生物典型的polyA加尾結(jié)構(gòu)，說明它的序列是完整的(圖1)，其中GenBank登錄號為DQ464066，推導(dǎo)的其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為47.1kD。

2.2 SQS基因的Southern雜交分析

圖2 SQS基因在裂殖壺菌基因組中的Southern雜交結(jié)果Fig.2 Southern blot analysis of S.limacinum SQS gene

圖3 裂殖壺菌SQS與其他物種SQS的氨基酸序列比對Fig.3 SQS gene-encoded amino acid sequence alignment between Schizochytrium limacinum and other species

分別用EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ和XbaⅠ酶切20μg裂殖壺菌基因組DNA，以SQS cDNA的402bp特異片段為探針，進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果均出現(xiàn)單一條帶(圖2)，表明該基因在裂殖壺菌基因組中以單拷貝形式存在。

另外，在開放閱讀框的兩端(包括整個(gè)ORF)設(shè)計(jì)一對特異引物，以裂殖壺菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約1.3kb的片段，回收后連接到T載體上進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)該序列與SQS的cDNA序列完全一致，說明得到的裂殖壺菌鯊烯合酶基因序列中不含內(nèi)含子。

2.3 同源性分析

用軟件Blastp分析發(fā)現(xiàn)，推導(dǎo)的SQS的氨基酸序列與其他已知的SQS序列具有一定的同源性和相似性，但同源性較低，與煙草、酵母、鼠和人SQS序列的同源性分別為38%、37%、40%和39%。與已知的SQS序列相比，裂殖壺菌SQS在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ區(qū)顯示出了SQS家族氨基酸序列的保守性(圖3)，在Ⅱ區(qū)存在典型的DXXXDD基序，Ⅳ區(qū)有保守的DXXED基序，確認(rèn)了該序列是SQS家族成員。

2.4 進(jìn)化分析

圖4 鯊烯合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic tree based on SQS gene-encoded amino acid sequence

運(yùn)用CLUSTL W程序?qū)α阎硥鼐徬┖厦负推渌阎孽徬┖厦赴被嵝蛄羞M(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果如圖4所示。裂殖壺菌的鯊烯合酶基因氨基酸序列并沒有與酵母等真菌類的鯊烯合酶基因氨基酸序列聚類，而是先與伊氏錐蟲、布朗葡萄藻及幾種植物的鯊烯合酶基因氨基酸序列聚類，其次再與動物的鯊烯合酶基因氨基酸序列聚類，然后才與酵母等真菌類微生物聚類。這說明裂殖壺菌的鯊烯合酶基因與植物的鯊烯合酶基因在進(jìn)化源祖上較接近，而真菌中鯊烯合酶基因呈多元分化。2.5目的融合蛋白的表達(dá)

在裂殖壺菌SQS基因的開放閱讀框兩側(cè)設(shè)計(jì)一對特異引物，分別加上EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)，以裂殖壺菌cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將測序正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定向連接到融合表達(dá)載體pGEX-4T-3多克隆位點(diǎn)EcoRⅠ和NotⅠ之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用PCR法篩選重組子，經(jīng)測序鑒定，得到融合表達(dá)重組體pGEX-SQS。

收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌體，經(jīng)超聲破壁后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明在分子質(zhì)量73kD(pGEX-4T-3中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶26kD與目的蛋白SQS 47.1kD融合)左右處有一條明顯的蛋白條帶(圖中箭頭標(biāo)示)，同預(yù)計(jì)的大小一致，而空載體及未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組體則沒有明顯的該條帶，表明pGEX-SQS重組質(zhì)粒在宿主菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能表達(dá)融合蛋白。通過比較重組菌體經(jīng)超聲波破碎后的沉淀和上清液的蛋白表達(dá)譜，可以看出目的蛋白主要以包涵體的形式存在于破壁沉淀中。

圖5 SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白在E. coli中的表達(dá)Fig.5 SDS-PAGE profile of recombinant protein

2.6 表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting檢測

圖6 重組蛋白的Western blotting分析Fig.6 Western blotting Identification of recombinant protein

為了驗(yàn)證表達(dá)蛋白的正確性，將融合蛋白經(jīng)GST標(biāo)簽純化樹脂進(jìn)行純化，純化后的融合蛋白進(jìn)行Westernblotting檢測。結(jié)果顯示，融合蛋白能特異性地與所制備的多克隆抗體進(jìn)行抗血清反應(yīng)，在分子質(zhì)量約73kD處出現(xiàn)了一條特異反應(yīng)帶，攜帶空載體的菌株蛋白樣品結(jié)果為陰性(圖6)，進(jìn)一步證實(shí)了所表達(dá)蛋白的正確性并表明其具有免疫原性。

3 討 論

目前，已有十幾個(gè)物種的SQS基因被克隆出來，其拷貝數(shù)在不同的物種中有所不同。其中，人和酵母的SQS基因都以單拷貝的形式存在[12-13]，而辣椒和綠藻Botryococcus braunii等物種的SQS基因至少為兩個(gè)拷貝[2-3]。本研究發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌的SQS基因以單拷貝的形式存在，且不含內(nèi)含子。這說明SQS基因具有多樣性。SQS基因的另一個(gè)特點(diǎn)是植物、動物和真菌之間的SQS氨基酸序列相似性比較低，同源性在35%～40%之間，但在植物之間(煙草與擬南芥)、動物之間(人與鼠)相似性較高，而真菌中呈多元分化的趨勢[14]。研究表明裂殖壺菌的SQS基因的氨基酸序列與煙草、酵母、鼠和人SQS序列的同源性分別為38%、37%、40%和39%，均不是很高，這與前人的研究結(jié)果一致[14]。比較不同物種的SQS氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)比較保守的區(qū)域，其中區(qū)域Ⅰ保守性較差，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ區(qū)高度保守，這4個(gè)區(qū)域被認(rèn)為與該酶的催化活性相關(guān)[15]。其中，Ⅱ區(qū)和IV區(qū)分別存在著富含天冬氨酸殘基的序列DXXEDD和DXXED，這兩個(gè)區(qū)被認(rèn)為是底物法尼基二磷酸的結(jié)合位點(diǎn)[16]；Ⅲ區(qū)和Ⅴ區(qū)被認(rèn)為是酶活性中心的催化位點(diǎn)，位點(diǎn)突變分析證實(shí)Ⅲ區(qū)中保守的酪氨酸(Tyr)和Ⅴ區(qū)中的苯丙氨酸(Phe)和谷氨酸(Glu)對保持SQS酶活性具有關(guān)鍵作用[17]。Ⅵ區(qū)(C末端區(qū))的保守性最低，但含有一個(gè)高度疏水序列，被認(rèn)為與酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的結(jié)合有關(guān)，可能是鯊烯合酶的一個(gè)膜靶位點(diǎn)和錨定信號[2,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，裂殖壺菌的SQS氨基酸序列也含有這6個(gè)保守區(qū)域，其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ區(qū)保守性較高，而且在Ⅱ區(qū)和Ⅳ區(qū)也分別存在著典型的DXXXDD和DXXED基序；Ⅵ區(qū)的保守性很低，但仍為一個(gè)疏水區(qū)域。這些結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)相符。

總之，本研究通過簡并引物與RACE相結(jié)合的方法克隆出了裂殖壺菌鯊烯合酶基因的全長cDNA片段，同源性分析發(fā)現(xiàn)它是SQS基因家族的新成員；并對其編碼區(qū)進(jìn)行了原核表達(dá)，為下一步的功能分析以及進(jìn)一步研究該基因在裂殖壺菌甾醇合成調(diào)控中的具體作用提供資料。

[1]布坎南B B, 格魯依森姆W，瓊斯R L. 植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)[M]. 瞿禮嘉, 顧紅雅, 白書農(nóng), 等, 譯. 北京: 科學(xué)出版社, 2004: 1035-1036.

[2]LEE J H, YOON Y H, KIM H Y, et al. Cloning and expression of squalene synthase cDNA from hot pepper[J]. Mol Cells, 2002, 13(3): 436-443.

[3]OKADA S, DEVARENNE T P, CHAPPELL J. Molecular characterization of squalene synthase from the green microalga Botryococcus braunii, race B [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2000, 373(2): 307-317.

[4]LIU Yan, YE Hechun, WANG Hong, et al. Molecular cloning, Escherichia coli expression and genomic organization of squalene synthase gene from Artemisia annua[J]. Acta Botanica Sinica, 2003, 45(5): 608-613.

[5]馮麗玲, 盧文婕, 曾慶平. 啤酒酵母鯊烯合酶基因的克隆及其基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 26(4): 394-397.

[6]戴住波, 錢子剛, 胡運(yùn)乾, 等. 金鐵鎖鯊烯合酶cDNA的克隆和功能鑒定[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 43(12): 1245-1250.

[7]李娜, 王世明, 陳軍, 等. SEFA-PCR 法克隆靈芝鯊烯合酶基因啟動子及其序列分析[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2006, 25(4): 592-598.

[8]YUE Jiang, KING Waifan, RAYMOND T S Z, et al. Fatty acid composition and squalene content of the marine microalga Schizochytrium mangrovei[J]. J Agric Food Chem, 2004, 52(5): 1196-1200.

[9]薩姆布魯克J, 拉塞爾D W. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 黃培堂, 譯. 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2002.

[10]HE Xianhui, XU Lihui, LIU Yi. Procedure for preparing peptidemajor histocompatibiliy complex tetramers for direct quantification of antigen - specific cytotoxic T lymphocytes[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(27): 4180-4187.

[11]徐麗慧, 洪岸, 何賢輝, 等. 重組人bFGF的原核表達(dá)及其高效價(jià)抗血清的制備[J]. 免疫學(xué)雜志, 2005, 21(3): 186-189.

[12]JENNINGS S M, TSAY Y H, FISCH T M, et al. Molecular cloning and characterization of the yeast gene for squalene synthase[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(6): 6038-6042.

[13]SUMMERS C, KARST F, CHARLES A D. Cloning, expression and characterization of the cDNA encoding human hepatic squalene synthase, and its relationship to phytoene synthase[J]. Gene, 1993, 136(2): 185-192.

[14]趙明文, 鐘家禹, 王南, 等. 鯊烯合酶的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2003, 43(5): 676-680.

[15]ROBINSON G W, TSAY Y H, KIENZLE B K. Conservation between human and fungal squalene synthase: similarities in structure, function, and regulation[J]. Mol Cell Biol, 1993, 13(5): 2706-2717.

[16]TANSEY T R, SHECHTER I. Structure and regulation of mammalian squalene synthase[J]. Biochim Biophys Acta, 2000, 1529(1/3): 49-62.

[17]GUAN Guimin, DAI Peihua, OSBORNE T F, et al. Multiple sequence elements are involved in the transcriptional regulation of the human squalene synthase gene[J]. J Biol Chem, 1997, 272(8): 10295-10302.

Cloning and Prokaryotic Expression of Squalene Synthase Gene from Schizochytrium limacinum

ZHU Lu-ying1,2，ZHU Qing-hua3,2，ZHANG Xue-cheng2,*
(1. School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China；2. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China,Qingdao 266003, China；3. Department of Biology, Dezhou College, Dezhou 253023, China)

A full length cDNA of squalene synthase (SQS) gene was isolated from Schizochytrium limacinum using homologybased cloning and RACE methods. Molecular biological analysis showed that the full length cDNA was of 1672 bp, with a 1338 bp open reading frame encoding 446 amino acids, and the SQS gene was a single copy gene in Schizochytrium limacinum. Homology analysis showed that Schizochytrium limacinum SQS cDNA had five consensus regions. The SQS cDNA was constructed into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-3 and expressed in E.coli BL21. SDS-PAGE and Western blotting analyses showed that the recombinant protein was mainly in the form of inclusion body, of which molecular weight was as expected, and had good immunogenicity.

Schizochytrium limacinum；squalene synthase；cDNA cloning；prokaryotic expression

Q786

A

1002-6630(2010)19-0263-05

2010-06-27

魯東大學(xué)校基金項(xiàng)目(LY20063307)；魯東大學(xué)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目

朱路英(1974—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)。E-mail：lyzhu@126.com

*通信作者：張學(xué)成(1939—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué)。E-mail：xczhang@ouc.edu.cn