副干酪乳桿菌對甘薯漿液中淀粉絮凝機理研究

李新華，趙曉陽，張荔力

副干酪乳桿菌對甘薯漿液中淀粉絮凝機理研究

李新華1，趙曉陽1，張荔力2

(1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧醫學院食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001)

為探討酸漿法分離甘薯淀粉傳統工藝中的淀粉沉降分離機理，進一步制備高效生物絮凝劑。本實驗采用Zeta電位測定、粒度分析及離子鍵檢測研究副干酪乳桿菌對甘薯淀粉絮凝沉淀的作用。結果表明：絮凝過程基于“架橋”機理，淀粉顆粒與菌體間靠離子鍵結合，絮凝作用使懸濁液中淀粉平均粒徑減小，密度增大，導致淀粉顆粒凝聚沉降；通過熱處理和酶處理實驗分析菌體起絮凝作用的活性成分組成，表明副干酪乳桿菌活性成分為蛋白類物質。

副干酪乳桿菌；甘薯淀粉；絮凝機理

絮凝作用是用以沉淀分離混合乳液中淀粉、蛋白質以及污水治理中提取分離有機物的主要方法[1]。微生物絮凝劑(microbial flocculant，MBF)是由微生物產生的一類具有一定絮凝活性的生物高分子化合物。與傳統化學絮凝劑鋁鹽、鐵鹽和聚丙烯酞胺相比，它具有高效、無毒、無二次污染的優點，是化學絮凝劑理想的替代產品[2-3]。絮凝機理的研究對微生物絮凝劑的開發應用有著重要的意義，在機理的研究中已取得重要進展，提出了如Butterfield黏質假說、吸附架橋和電中和作用等學說[4-5]，而傳統酸漿法沉降分離甘薯淀粉的機理尚未明確。本實驗對甘薯淀粉中副干酪乳桿菌絮凝機理進行深入的研究，揭示其對淀粉高效絮凝活性的原因，為進一步在甘薯淀粉生產中應用，改變甘薯淀粉傳統的生產工藝，提高甘薯淀粉質量及產量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種及試劑

副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)由遼寧醫學院食品學院微生物實驗室提供，本實驗室保存。

胰蛋白酶 國藥集團化學試劑有限公司；α-淀粉酶北京奧博星生物技術有限公司；EDTA、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、尿素 沈陽沈一精細化學品有限公司。

1.2 甘薯漿液體培養基

酵母粉5g、乳糖5g、K2HPO42g、吐溫-80 1mL、甘薯漿1000mL，調pH6.2～6.4，121℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.3 儀器與設備

Nano-ZS型Zeta電位分析儀 英國Malvern公司；Microtrac S3500激光衍射式粒度分布測定儀 美國麥奇克公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DNP-9082型電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；CR-21G高速冷凍離心機 日本日立公司；Sartorius標準型PB-10 pH計 上海摩速科學器材有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 副干酪乳桿菌發酵液的制備

取菌種按體積分數1%接種于甘薯漿液體培養基中，置25℃靜置培養48h，保存待用。

1.4.2 絮凝活性測定

將鮮甘薯與水按1:4(m/V)比例在組織搗碎機中打碎10min，80目篩子過濾。取濾液100mL加入10mL發酵液，混合攪拌使之充分混合，靜置5min后于550nm波長處測定吸光度(A1)，以空白培養基代替發酵液作對照實驗，550nm波長處測定吸光度(A2)。絮凝活性(以絮凝率表示)按式(1)計算。

1.4.3 副干酪乳桿菌發酵液絮凝活性的分布實驗

取10mL發酵液，5000r/min離心20min，留上清液備用。沉淀物用蒸餾水洗滌兩次后，加入10mL蒸餾水制成懸濁液，分別測定發酵原液、上清液以及沉淀物懸濁液的絮凝活性。

1.4.4 絮凝過程Zeta(ζ)電位的測定

1.4.4.1 pH值對Zeta電位的影響

稱取100mL的甘薯淀粉，其中加入10mL發酵液，將pH值調節到4.0～6.0，搖勻，靜置一段時間后，測定絮凝前后淀粉乳的ζ電位。

1.4.4.2 鹽溶液對Zeta電位的影響

稱取100mL的甘薯淀粉，其中加入10mL發酵液，將pH值調至4.5，添加質量濃度為1g/100mL的不同種類的鹽溶液和10mL發酵液，搖勻，靜置一段時間后，測定絮凝前后淀粉乳的ζ電位。

1.4.5 絮凝前后淀粉顆粒粒度的變化

將最佳條件下絮凝后靜置10min的淀粉乳上清液、沉淀以及原淀粉乳溶液，通過Microtrac S3500激光衍射式粒度分布測定儀，測定淀粉絮凝前后顆粒粒度分布變化。

1.4.6 菌體與淀粉顆粒之間結合鍵的檢測

分別用2mol/L EDTA、3mol/L HCl溶液和5mol/L尿素處理絮凝沉淀，輕輕搖勻，靜置一段時間后觀察現象。

1.4.7 副干酪乳桿菌絮凝活性物質成分的初步測定

1.4.7.1 熱穩定性實驗

將副干酪乳桿菌發酵液分別在30、40、50、60、70、80、90℃水浴中加熱30min，然后分別測定加熱后的發酵液對淀粉乳的絮凝率。

1.4.7.2 酶穩定性實驗

用250mmol/L EDTA及蒸餾水各洗兩次菌體，洗過的菌體細胞重新懸于分別加有蛋白酶、糖化酶的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液中，30℃保溫，在不同時間取樣，測定絮凝水平。

2 結果與分析

2.1 不同絮凝劑對甘薯淀粉絮凝活性的比較

通過對絮凝率的檢測，得知發酵原液、上清液以及沉淀物懸濁液的絮凝率分別為72.30%、23.41%、72.37%。沉淀物懸濁液的絮凝率很高，而上清液絮凝的效果較差，表明絮凝活性物質主要存在于菌體中，而不是菌體細胞的胞外代謝產物。因此，在后續的實驗中以菌體為對象，分析其絮凝機理。

2.2 絮凝過程Zeta電位的測定

2.2.1 pH值對ζ電位的影響

圖1 pH值對Zeta電位的影響Fig.1 Effect of pH value on Zeta potential

經測定，絮凝前淀粉顆粒ζ電位是－13.7mV，菌體ζ電位是－0.49mV。由圖1可見，菌體絮凝沉淀淀粉，當pH值為4.0時，淀粉乳ζ電位最低(絕對值)，為－2.29mV，隨著pH值的升高，ζ電位(絕對值)逐漸增大。pH值為5.0～6.0時，體系ζ電位(絕對值)較高，相應分散穩定性好。

2.2.2 鹽溶液對ζ電位的影響

當分別加入1g/100mL的NaCl、KCl、CaCl23種鹽溶液，pH值為4.5時，絮凝后淀粉顆粒電位分別為－2.47、－8.19、－10.40。當Na+與絮凝劑共同作用時，ζ電位(絕對值)小于pH4.5不加鹽溶液的淀粉乳ζ電位，對淀粉顆粒的絮凝能力遠遠高于單獨使用絮凝劑，由此說明Na+起到助凝劑的作用。

淀粉顆粒與菌體在水中都帶負電，它們之間存在較大的靜電斥力。要克服菌體與淀粉顆粒之間的靜電排斥力，就一定存在某種特殊的作用力。數值顯示，當淀粉顆粒表面電位降低到一定低點時，此淀粉顆粒的穩定性降到某個程度，顆粒將很快聚沉。因此，在絮凝過程中，每個菌體可以和多個淀粉顆粒結合，這樣便形成了“架橋”作用，從而形成大顆粒迅速沉降下來。而在同一pH值下，ζ電位隨著Na+的添加，向零電點處靠近，這說明Na+所帶正電荷與淀粉顆粒表面所帶負電荷發生了電中和作用。由此得出，Na+的加入導致電中和作用壓縮雙電層，使菌體對淀粉顆粒的吸附凝聚量增加。

2.3 絮凝前后淀粉顆粒粒度的變化

圖2 絮凝前后淀粉顆粒粒度的變化Fig.2 Change in starch granular size before and after flocculation

為考察發酵液作用后淀粉粒徑變化情況，經粒度分析儀測定得到的結果見圖2。經發酵液處理前后，甘薯淀粉溶液中顆粒粒徑分布發生明顯變化，處理后的甘薯漿液中的淀粉顆粒粒徑變小。說明經發酵液處理，淀粉顆粒被菌體吸附，由于淀粉顆粒自身的雙電層在吸附過程中被破壞，使得粒徑變小，顆粒密度增大，同時淀粉顆粒間產生“架橋”現象，形成較大的絮凝體并由重力作用在漿液中迅速下沉。該結果直觀上顯示了發酵液的作用機理為菌體與淀粉顆粒間的吸附和“架橋”作用。

2.4 菌體與淀粉顆粒之間結合鍵的檢測

加入EDTA和HCl的絮凝沉淀中絮塊大量分解，加入尿素的絮凝沉淀無明顯的解絮現象。由此現象可知，絮凝沉淀對EDTA和HCl敏感，而對尿素不敏感，因為EDTA和HCl能與淀粉顆粒結合，破壞離子鍵，從而發生解絮現象。而尿素和淀粉顆粒之間可形成氫鍵。因此可以推測絮凝劑與甘薯淀粉之間的結合可能是靠離子鍵結合的。

2.5 絮凝活性物質成分測定

據資料[6-7]報道，菌體絮凝作用的主要活性成分可能是蛋白質類或糖類物質。為了分析副干酪乳桿菌主要起絮凝作用的活性成分，本研究進行酶解和熱作用實驗，進一步了解絮凝作用機理。

2.5.1 絮凝活性物質的熱穩定性

圖3 溫度對絮凝活性物質的影響Fig.3 Effect of temperature on flocculating activity

某些由多糖構成的絮凝劑基本不受溫度的影響[8-9]，而以蛋白質為主要成分的微生物絮凝劑的活性受溫度影響很大，高溫時變性，喪失部分絮凝能力[10]。由圖3可知，其絮凝率隨著溫度的升高而迅速降低。在50℃以后，副干酪乳桿菌發酵液幾乎沒有絮凝活性。說明絮凝活性物質不具有熱穩定性，絮凝活性受溫度的影響較大。這一結果也進一步說明該絮凝活性物質的絮凝作用是由菌體細胞本身產生的，它的主要有效成分是蛋白類物質。

2.5.2 絮凝活性物質的酶穩定性

由圖4可知，在胰蛋白酶催化水解作用下，絮凝活性物質的絮凝水平迅速下降，在20min時，絮凝活性降低到低于10%。因此，該絮凝活性物質對胰蛋白酶的作用是敏感的，在胰蛋白酶的作用下其絮凝活性顯著下降，這是因為絮凝活性物質在酶的作用下水解，從而引起多聚物分子質量降低。證明該絮凝活性物質絮凝作用主要來自蛋白質。而α-淀粉酶對絮凝活性影響較小，糖類不起主要絮凝作用。

圖4 酶對絮凝活性物質的影響Fig.4 Effect of enzyme on flocculating activity

3 結 論

副干酪乳桿菌發酵液在甘薯漿液中對淀粉具有明顯的絮凝活性，實驗證明起絮凝作用活性物質主要存在于菌體中，而不是菌體細胞的胞外代謝產物。甘薯漿液中的淀粉顆粒在絮凝后粒徑變小，顆粒密度增大，菌體大分子通過離子鍵作用與多個淀粉顆粒結合，并在淀粉顆粒間產生“架橋”現象，形成較大的淀粉絮凝體沉淀下來，同時Na+作為助凝劑起到電中和作用。絮凝活性物質的主要有效成分是蛋白質類物質。

本研究雖然初步證明絮凝活性成分是蛋白質類物質，但這類物質究竟出于哪種蛋白，是簡單蛋白質還是復合蛋白質，在菌體上是如何分布的，以及從菌體上分離出來還能否具有絮凝活性，都還有待于進一步研究。副干酪乳桿菌對于其他成分的絮凝作用如何，能否在污水治理等過程中作為生物絮凝劑，也有待于進一步實驗證明。

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Flocculation Mechanism of Sweet Potato Starch by Addition of Lactobacillus paracasei-fermented Sweet Potato Slurry

LI Xin-hua1，ZHAO Xiao-yang1，ZHANG Li-li2
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Food Science and Engineering, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

The goal of this work was to explore the mechanism of sedimentation separation of starch by acidic steeping liquor method so as to provide experimental guidance for the development of highly efficient bioflocculant. The Lactobacillus paracasei-fermented sweet potato slurry and its centrifugation supernatant and resuspended precipitate were separately added with sweet potato starch, and the flocculation of sweet potato starch in the three liquors was studied by the determination of Zeta potential, granular size and ionic bond. The flocculation of sweet potato starch was based on the bridging mechanism, and starch granules were conjugated with bacterial cells through ionic bond, and after flocculation, mean starch granular size decreased and granular density increased, resulting in the aggregation and sedimentation of starch granules. Moreover, from the results of experiments on the thermal and enzymatic stability of substances with flocculating activity, proteins were the active components in Lactobacillus paracasei responsible for flocculation.

Lactobacillus paracasei；sweet potato starch；bridging mechanism

TS201.3

A

1002-6630(2010)19-0273-04

2010-01-22

李新華(1955—)，男，教授，碩士，主要從事糧油深加工與轉化研究。E-mail：lixh.syau@163.com