半巢式PCR法構建天然噬菌體單域重鏈抗體文庫

涂 追，許 楊,*，何慶華，陶 勇

半巢式PCR法構建天然噬菌體單域重鏈抗體文庫

涂 追1,2，許 楊1,2,*，何慶華1,2，陶 勇2

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

目的：構建天然噬菌體單域重鏈抗體文庫，淘選可應用于食品安全檢測的單域重鏈抗體。方法：以未經免疫的健康羊駝(Lama pacos)外周血為起始材料，提取RNA反轉錄為cDNA，根據(jù)重鏈抗體保守序列設計引物，通過半巢式PCR法擴增獲得全套重鏈抗體可變區(qū)編碼基因，將其克隆至噬菌粒pHEN1，電轉化大腸桿菌TG1得到初級抗體庫，輔助噬菌體KM13感染后得到噬菌體展示庫。采用固相淘選法分別對3種人工抗原進行淘選。結果：單域重鏈抗體編碼基因得到有效擴增，經10次電轉化獲得初級文庫，命名為SNAL，實際庫容量達到1.6×107個獨立克隆，菌落PCR鑒定結果表明，克隆效率約為87%，輔助噬菌體救援后得到的展示文庫命名為SNA-PDL，滴度達1013CFU/mL。對3種不同人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA和AFB1-OVA的淘選均有富集現(xiàn)象。結論：構建了天然噬菌體單域重鏈抗體文庫，文庫的多樣性較好，可以用于后續(xù)淘選。

單域重鏈抗體；VHH抗體；噬菌體文庫；羊駝；半抗原

1993年，Hamers-Casterman等[1]報道在駱駝血清中大量存在一種天然缺失輕鏈的抗體，即重鏈抗體(heavychain antibodies，HCAbs)。克隆重鏈抗體的可變區(qū)得到只由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體稱為VHH抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，其晶體結構為直徑2.5nm、長4nm的圓柱體，也被稱為納米抗體(nanobody，Nb)[2]或單域重鏈抗體。

單域重鏈抗體分子質量小(約15kD)，具有易表達、高水溶性、耐高溫、耐極度pH值等獨特性質，有利于降低檢測成本，縮短研發(fā)周期，目前已被廣泛用于基礎研究、醫(yī)學診斷和檢測、抗體藥物開發(fā)等領域[3]。在食品安全檢測領域，相關的研究和應用報道較少，已有的報道多為通過免疫動物，構建免疫文庫，用于淘選針對特定抗原的單域重鏈抗體[4-5]。免疫庫的優(yōu)點是可以較為容易地篩選到針對免疫抗原的高親和力抗體，但是構建免疫庫需要較長時間免疫動物，如果抗原為有毒有害物質，可能對實驗動物造成不良影響，而且某一特定的免疫庫只能產生針對特定抗原的抗體，不能作為一個廣泛應用的平臺[6]。本研究采用噬菌體展示技術構建天然噬菌體單域重鏈抗體文庫，以作為通用的技術平臺，重復用于多種抗原的篩選，對3種小分子半抗原物質進行初步淘選，旨在為進一步開發(fā)基于單域重鏈抗體的檢測方法和工具提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

淋巴細胞分離液(1.077) 上海生工生物工程服務有限公司；RNAiso、RT-PCR試劑盒、PrimeSTAR高保真DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA試劑盒 TaKaRa公司；T4連接酶 New England Biolab公司；酵母膏、蛋白胨 英國Oxoid公司；其他化學試劑均為國產分析純。

DON人工抗原(DON-MBSA)是將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)與甲基化修飾牛血清白蛋白(MBSA)的共價偶聯(lián)；諾氟沙星人工抗原(NOR-BSA)是將諾氟沙星(norfloxacin，NOR)與牛血清白蛋白(BSA)的共價偶聯(lián)；黃曲霉毒素B1人工抗原(AFB1-OVA)是將黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)與卵清蛋白(OVA)的共價偶聯(lián)。3種人工抗原均為實驗室自制[7-9]。

1.1.2 淋巴細胞

采用真空采血管收集10mL健康羊駝外周血，用淋巴細胞分離液密度梯度離心收集單核細胞。

1.1.3 菌株及噬菌粒

大腸桿菌TG1、噬菌粒pHEN1和輔助噬菌體KM13由中國科學院上海生命科學研究院馬維駿博士惠贈[10]。

1.1.4 引物

引物設計主要參考文獻[11]并作適當修改，見表1。其中，AlpVh-LD位于抗體編碼區(qū)的前導序列，AlpVh-SfiI位于可變區(qū)的框架區(qū)1(framework region 1，F(xiàn)R1)并在其5'端引入了Sfi I酶切位點及保護堿基，AlpVHHR1-NotI和AlpVHHR2-NotI分別位于兩種重鏈抗體的鉸鏈區(qū)(hinge region)，在5'端引入了Not I酶切位點及保護堿基。M13-R和pHEN-R兩條引物為噬菌粒pHEN1的通用引物。

表1 文庫構建及鑒定所用的引物Table 1 Primers used for library construction and characterization

1.2 方法

1.2.1 淋巴細胞的分離、總RNA的提取及反轉錄

將15mL枸櫞酸抗凝的羊駝外周血以等體積磷酸緩沖液PBS(pH7.4)稀釋，用1.077型淋巴細胞分離液分離收集淋巴細胞，800×g離心20min。參照RNAiso試劑說明書提取總RNA，以Oligo dT反轉錄獲得cDNA，反應條件為42℃、30min，50℃、60min，72℃、15min。

1.2.2 VHH基因的擴增及其與載體的連接

采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經半巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因。第一輪PCR分別以引物AlpVh-L和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-L和AlpVHHR2-NotI擴增cDNA，反應條件為：98℃、10s，50℃、20s，72℃、40s，35個循環(huán)，72℃延伸10min。將第一輪PCR產物稀釋適當倍數(shù)后作為模板，分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI進行擴增，反應條件為：98℃、10s，50℃、20s，72℃、40s，5個循環(huán)，98℃、10s，68℃、40s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。經DNA片段回收試劑盒回收、定量，于－20℃保存?zhèn)溆谩⑹删HEN1和PCR擴增產物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經瓊脂糖凝膠回收、定量后，分別以物質的量比1:1、1:3和1:5，16℃過夜連接。

1.2.3 噬菌體擴增、純化和滴度測定

[12]進行。

1.2.4 噬菌體文庫的構建

選擇最佳的物質的量比，以總量1μg載體與PCR產物進行連接。連接產物經乙醇沉淀后，溶于10μL無菌水中，分10次進行電穿孔轉化大腸桿菌TG1，感受態(tài)細胞的制備與轉化參照文獻[12]進行。取10μL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×YT(酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基)培養(yǎng)板，計算庫容。其余部分全部涂布于24cm × 24cm 氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h。用10mL，2×YT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終質量濃度15～30g/100mL甘油，分裝，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)計算的庫容量結果，接種10倍庫容量的活細胞于5mL的2×YT(含2% 葡萄糖、100μg/mL 氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，30℃，220r/min培養(yǎng)至OD600nm達0.5，按感染復數(shù)20:1加入輔助噬菌體，37℃、220r/min培養(yǎng)60min。將培養(yǎng)物在3000×g離心10min，用50mL的2×YT(含100μg/mL 氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素) 培養(yǎng)液重懸沉淀，30℃、220r/min過夜培養(yǎng)后，3000×g離心取上清，按標準方法純化噬菌體[9]，即得到噬菌體抗體文庫，取10μL測定滴度，其余分裝于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 文庫的鑒定

隨機挑取40個克隆進行分析，利用載體上的通用引物(M13-R和pHEN-R)進行PCR驗證。

1.2.6 噬菌體文庫初步淘選

用PBS稀釋抗原至50～100μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被過夜，吸出包被液，PBS洗板3次，3% BSAPBS在37℃封閉2h，PBS洗板3次，加入噬菌體抗體庫100μL(約含2×1011CFU)，37℃孵育1.5h，用PBST (含0.5%吐溫-20)洗板3次(逐輪增加1次)，再用TBS (Tris-buffered saline)緩沖液洗板10次(逐輪增加5次)。以100μL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH2.2)洗脫吸附在酶標孔中的噬菌體，用50μL Tris-HCl(1mol/L，pH8.0)中和洗脫物，取10μL用于滴度測定，其余洗脫物擴增后用于下一輪淘選。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取與分析

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

經血球計數(shù)板計數(shù)，從羊駝外周血收集到約3×107單個核細胞。紫外分光度法測定提取總RNA的OD260nm/ OD280nm=2.0，表明提取的總RNA沒有明顯的蛋白質等有機物污染，根據(jù)OD260nm值計算，共提取總RNA約30μg。

圖1顯示，28S rRNA和18S rRNA兩條帶清晰，經Quantity One 4.6.1生物圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)分析，28S rRNA條帶的亮度為18S rRNA條帶亮度的1.9倍，表明總RNA分子完整、無降解。

2.2 全套可變區(qū)基因的獲取

分別用0.5、2.5、5μL總RNA進行反轉錄合成cDNA，混合后作為PCR的模板，用針對短鉸鏈區(qū)和長鉸鏈區(qū)的引物分別擴增兩種不同亞群的單域重鏈抗體可變區(qū)。第一輪PCR擴增獲得了在500～1000bp范圍內的彌散條帶(圖2)，預期第一輪擴增產物(應為在500bp左右的彌散條帶)在此范圍內。

圖2 第一輪PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the first-round PCR products

取10μL回收后的第一輪PCR產物，稀釋10、100、1000、10000倍后，分別取1μL作為第二輪PCR的模板，結果顯示，當模板稀釋10倍時所獲得的目的產物(約500bp)量較多(圖3，泳道1)，故以稀釋10倍的第一輪產物為模板進行大量的PCR擴增。第二輪PCR擴增獲得了450bp 左右的彌散條帶(圖4，箭頭所示)，與預期相符。

圖3 第二輪PCR模板量優(yōu)化Fig.3 Optimization of template for the second-round PCR

圖5 菌落PCR鑒定初級文庫SNALFig.5 PCR analysis of colonies randomly picked from SNAL

表2 三種抗原淘選結果Table 2 Results of library panning with DON-MBSA, NOR-BSA and AFB1-OV

圖4 第二輪PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of the second-round PCR products

2.3 連接與電轉化

將第二輪PCR產物酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收450bp左右條帶，與噬菌粒連接。當連接體系中外源片段和噬菌粒載體的物質的量比為3:1時，電轉化后得到的菌落數(shù)最多，以此比率進行大規(guī)模連接。經10次電轉化獲得了初級文庫，命名為SNAL，菌落計數(shù)測定結果顯示初級文庫容量達到2×107個獨立克隆。

2.4 文庫鑒定

選擇50～200個單菌落的SNAL文庫菌落計數(shù)平板，隨機挑取40個菌落進行菌落PCR鑒定克隆效率，由電泳結果可見，陽性對照能擴增出條帶，陰性對照未見條帶，說明PCR鑒定結果可靠，在40個克隆中有35個能擴增出400～750bp條帶(圖5)，提示初級文庫SNAL的克隆效率約為87%，因此該初級文庫的實際庫容為1.6× 107個(其中包含冗余序列，串聯(lián)序列以及無義突變序列等無效克隆)。

2.5 文庫的淘選

分別以3種人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA和AFB1-OVA為配基，對文庫進行淘選，結果顯示，噬菌體回收率逐輪提高，對于3種人工抗原都存在不同程度的富集(表2)，提示文庫具有較好的多樣性。

3 討 論

單域重鏈抗體文庫的構建早期是以駱駝屬(Camelus sp.)動物為來源[13]。近年來，有報道以羊駝屬(Lama sp.)動物為來源，構建特異性單域重鏈抗體免疫庫[14]。與駱駝屬動物相比，羊駝(Lama pacos)體型較小，易于獲得和飼養(yǎng)。

在羊駝的血液中，天然存在3種免疫球蛋白IgG1、IgG2和IgG3，它們的物質的量比大致為50:30:20[11]，其中IgG2和IgG3是缺失輕鏈的重鏈抗體，IgG2是具有長鉸鏈區(qū)的重鏈抗體，IgG3是具有短鉸鏈區(qū)的重鏈抗體。本研究根據(jù)羊駝單域重鏈抗體的保守序列，設計了兩套引物分別擴增IgG2和IgG3的可變區(qū)，更有利于獲得全部的重鏈抗體可變區(qū)基因。

重鏈抗體可變區(qū)具有較長的CDR3區(qū)，而且不同的抗體長度差異較大[15]，因此最終的擴增產物應為一定大小范圍的DNA片段，而不是一條特異性擴增條帶。為了盡可能擴增出所有的抗體序列，在進行第一輪PCR反應的過程中，采用了較低的退火溫度(50℃)，產生了大量非特異性擴增產物(圖3)，在第二輪PCR反應過程中，為了增加特異性，采用了兩步法擴增反應，并對模板濃度進行了優(yōu)化從而得到大量目的產物(約450bp，圖4)。對文庫菌落PCR分析結果顯示，文庫SNAL中克隆的外源DNA片段大小在240～500bp之間(大多數(shù)為400bp左右，圖5)，表明該文庫中存在一些非特異性PCR擴增產物。可以通過改變PCR反應條件和縮小割膠回收范圍提高文庫中目的編碼序列的比率，但是會增加丟失抗體編碼基因的風險[16]。

噬菌體抗體庫技術結合了PCR技術和噬菌體展示技術，將特定抗體分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一噬菌體內，便于獲取所需特定抗體的編碼基因[17]。天然抗體庫采用未經主動免疫的健康個體樣本，對于特定的抗原沒有偏向性，理論上可克隆出巨大數(shù)量的抗體，以結合多種多樣的抗原[18]。實際上抗體庫的容量和多樣性與獲得特定抗體的親和力和種類成正相關[19-20]。本研究用噬菌體文庫SNA-PDL對3種不同的人工抗原進行淘選，結果表明對3種人工抗原均有明顯的富集現(xiàn)象，說明文庫中存在能夠特異性結合這3種人工抗原的噬菌體顆粒，初步驗證了文庫的多樣性，有望獲得針對這3種小分子半抗原的單域重鏈抗體，為進一步建立相應的檢測方法提供物質和技術基礎。

與單鏈抗體(single-chain variable fragment，ScFv)、抗原結合片段(fragment of antigen-binding，F(xiàn)ab)等小分子抗體庫相比，單域重鏈抗體庫具有更多的優(yōu)勢。通過PCR技術可以直接獲得完整的單域重鏈抗體編碼基因，簡化了文庫構建步驟，抗體分子片段小，有利于構建大容量抗體庫，易于在大腸桿菌中表達[21]。

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Construction of Alpaca-derived Naive Single-domain Antibody Phage Display Library by Semi-nested PCR

TU Zhui1,2，XU Yang1,2,*，HE Qing-hua1,2，TAO Yong2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To construct a single-domain heavy chain antibody phage display library for food safety detection. Methods: Total RNA was purified from peripheral lymphocytes of two healthy non-immune alpaca (Lama pacos) and directly used for complementary DNA (cDNA) synthesis. The repertoire of VHH encoding DNAs was amplified by semi-nested PCR, and the PCR products were cloned into the phagemid vector pHEN1. Through the electroporation of E. coli TG1, a primary library was established and then rescued by the helper phage KM13 to generate a phage display library. The generated phage display library was used to pan three different artificial antigens by solid phage biopanning. Results: The VHH encoding DNAs was amplified. After electroporating for 10 times, the primary library named as SNAL was generated containing more than 107independent clones. The cloning efficiency was up to 87%. The titter of the phage display library obtained after the rescue with KM13 named as SNA-PDL was up to 1013CFU/mL. All antigen screening data exhibited a significant enrichment in phage particles. Conclusion: A naive single-domain antibody phage display library has been successfully constructed. This library exhibits good diversity and can be used to the recovery of binders.

single-domain heavy chain antibody；VHHs；phage display library；alpaca；hapten

Q789

A

1002-6630(2010)19-0299-05

2010-06-30

國家中小企業(yè)創(chuàng)新基金項目(09C26213604449)；江西省教育廳青年科學基金項目(GJJ09442)；江西省自然科學基金項目

涂追(1982—)，男，博士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：tuzhui@yahoo.com.cn

*通信作者：許楊(1951—)，女，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：xuyang1951@yahoo.com.cn