深海古菌Thermococcus siculi HJ21高溫普魯蘭酶基因的克隆及表達

王淑軍，呂明生，李華鐘，徐金利,，焦豫良，房耀維，劉 姝

深海古菌Thermococcus siculi HJ21高溫普魯蘭酶基因的克隆及表達

王淑軍1，呂明生1，李華鐘2，徐金利1,2，焦豫良1，房耀維1，劉 姝1

(1.淮海工學院食品工程學院，江蘇 連云港 222005；2.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

根據NCBI上公布的普魯蘭酶基因的保守序列設計簡并引物，以Thermococcus siculi HJ21基因組DNA為模板進行PCR，得到T. siculi HJ21普魯蘭酶的基因，測序后通過Blast(NCBI)數據庫比對和分析表明擴增基因有一個4056bp、編碼1351個氨基酸的開放閱讀框，為一新的普魯蘭酶基因。將該基因插入表達載體pET28a，并轉化Escherichia coli BL21(DE3)，經IPTG誘導，測定普魯蘭酶比活力。重組轉化子的細胞破碎液有高溫普魯蘭酶活性，SDS-PAGE電泳結果顯示出分子質量約為150kD的特異性條帶。

Thermococcus siculi HJ21；普魯蘭酶；基因；PCR

普魯蘭酶(pullulanase，EC 3.2.1.41) 是一種能夠專一性水解普魯蘭多糖和其他多糖如淀粉、糖原和極限糊精中的α-1,6糖苷鍵，從而剪下整個側枝，形成直鏈淀粉的脫支酶[1-2]。它在淀粉加工工業中有著非常重要的用途，可大規模地提高淀粉的利用率和生產效率[3-4]。普魯蘭酶可以單獨使用，亦可與其他酶配合使用，相輔相成收到良好的效果[5-7]。該酶已被較成熟地應用于高葡萄糖漿、高麥芽糖漿和干啤酒生產中[8-9]。目前我國對于該酶的研究還處于實驗室研究階段，因此無此酶的生產技術，普魯蘭酶制品主要依賴進口[10]。

來自嗜熱菌Thermococcus siculi HJ21的耐高溫普魯蘭酶的最適反應溫度為95℃，且溫度的穩定性較好，因而具有較高的工業應用價值。本實驗利用分子生物學技術，克隆T. siculi HJ21的普魯蘭酶基因，并在大腸桿菌中進行表達，以為該酶的工業應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

Thermococcus siculi HJ21、Escherichia coli DH5α、E. coli BL21(DE3)為淮海工學院江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室保藏。T-A克隆載體pMD18-T TaKaRa(大連)公司；pET28a表達載體由中國科學院海洋研究所秦松研究員饋贈。

1.1.2 酶與試劑

DNA聚合酶、氨芐青霉素、膠回收試劑盒 上海生工生物工程技術服務有限公司；DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、 Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 寶生物工程(大連)有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基及培養條件

大腸桿菌的培養使用LB培養基(液體LB培養基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母粉、10g NaCl；固態LB培養基：在液體培養基的基礎上添加0.02g/mL瓊脂粉)，37℃培養。T. siculi HJ21的培養用自行設計的厭氧培養裝置，培養基為改良的YPS培養基按參考文獻[11]進行配制。

1.1.4 引物合成和測序

引物合成和測序均由上海生工生物工程服務有限公司完成。引物序列及用途見表1。

表1 克隆T. siculi HJ21高溫普魯蘭酶全長DNA所用引物Table 1 Primers used for the cloning of full-length DNA of T. siculi HJ21 pullulanase gene

1.2 方法

1.2.1 T. siculi HJ21 高溫普魯蘭酶基因的克隆

1.2.1.1 T. siculi HJ21基因組總DNA的制備

基因組總DNA的提取采用TaKaRa公司的試劑盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0進行提取。

1.2.1.2 部分DNA序列的PCR

根據已報道的普魯蘭酶基因保守區設計簡并引物(F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4)。PCR反應體系(25μL)的組成為：10×buffer 2.5μL、Mg2+(25mmol/L) 2.5μL、引物1(P1)，100μmol/L) 0.5μL、引物2(P2)，100μmol/L) 0.5μL、dNTP(10mmol/L) 0.5μL、Taq酶 (5U/μL) 0.2μL、模板1μL、ddH2O定容至25 μL。PCR按照如下程序進行擴增：94℃預變性4min，然后進入以下循環：94℃變性1min；54℃退火40s；72℃延伸，共進行35個循環。循環結束后，72℃延伸10min，4℃保存。取PCR反應產物以0.01g/mL 瓊脂糖凝膠電泳進行分析、膠回收(膠回收參閱上海生工生物工程技術服務有限公司上海生工公司的小量膠回收試劑盒說明書，凝膠的制備和操作參照文獻[12]，并克隆到pMD18-T載體上，轉化E.coli DH5α，藍白斑篩選和酶切鑒定陽性克隆，挑選正確的陽性克隆測序。

1.2.1.3 序列拼接

將簡并引物所獲得的部分DNA序列用DNAMAN Version6.0進行序列拼接，結合測序峰圖進行序列校正，最后獲得拼接好的序列，見圖1。

圖1 DNA序列拼接Fig.1 DNA fragment assembly

1.2.1.4 全長DNA的擴增

根據序列拼接結果設計兩端引物F5和R5，按94℃預變性4min；然后94℃ 40s，56℃ 40s，72℃ 4min，35個循環；72℃延伸10min，4℃保存。將PCR反應產物以0.007g/mL脂糖凝膠電泳進行分析和膠回收，并克隆到pMD18-T載體上構建得到新質粒pMD18-T-pull，并轉化E. coli DH5α，藍白斑篩選和酶切鑒定陽性克隆，提取的質粒pMD18-T-pull凍存，20℃備用。

1.2.2 目的基因的表達及活性鑒定

1.2.2.1 大腸桿菌表達質粒的構建及轉化

提取含有T. siculi HJ21普魯蘭酶基因的質粒pMD18-T-pull，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收并與以同樣雙酶切的pET28a質粒以3:1的物質的量比進行混合連接，構建得到新質粒pET28a-pull，并轉化到大腸桿菌DH5α，以Amp+篩選陽性轉化子，提取質粒pET28a-pull凍存－20℃備用。大腸桿菌感受態細胞的制備與轉化按文獻[13]方法進行操作。大腸桿菌工程菌的誘導按文獻[14]方法進行操作。

1.2.2.2 普魯蘭酶比活力測定

粗酶液制備：將發酵液用三層濾紙抽濾除去殘余硫顆粒及雜質后，以10000r/min離心15min，除去菌體，取上清液鹽析過夜，每100mL上清液加39.6g硫酸胺，然后再以11000r/min離心30min，取沉淀透析，透析結束后以12000r/min離心10min，除去雜質，所得上清液即為粗酶液，置于－40℃冰箱保存。

將50μL粗酶液加入到150μL普魯蘭乙酸鈉緩沖液(200mmol/L，pH6.0)中，在95℃水浴中反應15min，用DNS測定還原糖量[15]。在上述條件下，每分鐘催化底物產1μmol麥芽糖的酶量作為一個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 T. siculi HJ21普魯蘭酶基因的擴增及序列分析

圖2 簡并引物擴增產物Fig.2 Electrophoresis of the PCR products of pulluanase gene with four pairs of degenerate primers

根據NCBI中公布的耐高溫普魯蘭酶序列，利用ClustalX軟件對序列進行對比，找到保守氨基酸序列，設計簡并引物進行PCR，獲得長度約為280、2300、200bp及2000bp的片段，結果見圖2。將片段回收后，測序結果顯示所擴增得到的片段經拼接后全長為4056bp，編碼1351個氨基酸。然后根據拼接后的序列設計引物擴增普魯蘭酶基因，并與pMD18-T相連，獲得pMD18-T-pull質粒，結果見圖3。通過其編碼的氨基酸序列在GenBank數據庫中用Blast(Basic Local Alignnlentsemh Tool)進行相似性搜索比對可以看出，T. siculi HJ21與T. hydrothermalis AL662 (AF068255)的親緣關系最近，堿基序列的相似性達到82%，氨基酸序列的相似性達到87%。

圖3 普魯蘭酶編碼基因Fig.3 Electrophoresis of the full-length PCR products of pulluanase gene

2.2 重組質粒的構建和酶切驗證

將pMD18-T-pull進行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，電泳膠回收4.0kb左右的條帶，對pET28a質粒進行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，電泳膠回收5.3kb的條帶；將上述膠回收產物以3:1的物質的量比進行混合，構建過程見圖4。

圖4 pET-28a-pull的構建Fig.4 Construction map of recombinant expressing vector pET-28apull

圖5 pET-28a-pull經BamHⅠ和SalⅠ雙酶切Fig.5 Double enzymatic digestion identification of pET-28a-pull with BamHⅠ and SalⅠ

將重組質粒 pET28a-pull用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，酶切后于0.007g/mL的瓊脂糖凝膠中電泳驗證，電泳結果顯示產生4.0kb和5.3kb兩條帶，證明重組表達質粒構建正確，結果見圖5。

2.3 普魯蘭酶基因在大腸桿菌中的表達

將pET28a、pET28a-pull分別轉化E. coli BL21 (DE3)，轉化子接種于含有50μg/mL卡那霉素的液體LB培養基中，37℃振蕩培養至對數期后期，加入IPTG，使其終濃度為1mmol/L，于37℃條件下誘導4h后離心收集菌體用緩沖液洗滌懸浮，于冰水中超聲破碎細胞，測定酶比活力。結果表明，普魯蘭酶基因在大腸桿菌中成功表達。SDS-PAGE結果表明，經IPTG誘導后普魯蘭酶基因在大腸桿菌中得到了較好的表達，150kD附近出現了明顯的蛋白條帶，表達蛋白占細胞總蛋白的8%，結果見圖6。

圖6 重組酶液SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE of recombinant pullulanase

3 討 論

該研究實現了普魯蘭酶基因在大腸桿菌中的表達，表達采用了T7強啟動子，但酶的表達水平不高，全細胞蛋白SDS-PAGE電泳結果表明，含重組質粒的細胞和含pET28a空載體的細胞用IPTG誘導后所獲電泳圖譜并沒有明顯差別，這說明重組蛋白的表達量不高。利用一個在線分析大腸桿菌稀有密碼子的網站http://nihserver. mbi.ucla.edu/RACC/分析T. siculi HJ21普魯蘭酶基因中的稀有密碼子，共有稀有密碼子99個，其中稀有精氨酸密碼子有28個，稀有亮氨酸密碼子有4個，稀有異亮氨酸密碼子有41個，稀有脯氨酸密碼子有26個，而在大腸桿菌稀有密碼子的tRNA中，以tRNAArg (AGG/ AGA)含量最低，對表達的影響也最大，因而顯著影響表達水平。

來源于T. siculi HJ21的普魯蘭酶由于其反應溫度高、對Ca2+依賴性小、酶的穩定性高等特點，因而受到越來越多的關注。但由于超嗜熱微生物生長環境的特殊性(高壓、厭氧以及低營養)，利用傳統的生物發酵技術難以實現超嗜熱微生物的工業生產。因此，目前主要通過基因工程的手段把優良的酶基因在適宜的宿主系統中進行高效表達，從而實現嗜熱酶的工業應用。本實驗利用分子生物學手段，展現了來源于T. siculi HJ21的普魯蘭酶基因的表達，為該酶的進一步研究和應用奠定了基礎。近年來雖然已經將嗜熱普魯蘭酶在不同的宿主中表達成功，但是表達量比較低，因此，可以通過分子定向進化技術提高其表達量，以滿足工業應用的要求。

[1]ADINARAYANA K, SUREN S. Improved high thermal stability of pullulanase from a newly isolated thermophilic Bacillus sp. AN-7[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(7): 399-1404.

[2]SUBHASH U, SINGHAL R, KAMAT M, et al. Induction of pullulanase production in Bacillus cereus FDTA-13[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(4): 856-859.

[3]DOMAN-PYTKA M, BARDOWSKI J. Pullulan degrading enzymes of bacterial origin[J]. Microbiology, 2004, 30: 107-121.

[4]GOMES I, GOMES J, STENIER W. Highly thermostable amylase and pullulanase of the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus: production and partial characterization[J]. Bioresource Technology, 2003, 90: 207-214.

[5]徐金利, 呂明生，王淑軍，等. 嗜熱古菌Thermococcus sp.HJ21產高溫普魯蘭酶條件和酶學性質[J]. 食品與生物技術學報, 2009, 28 (2): 243-249.

[6]HORVTHOV V, GODNY A, TURDK E, et al. α-Amylase from Thermococcus hydrothermalis: recloning aimed at the improved expression and hydrolysis of corn starch[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(6): 1300-1305.

[7]WANG Shujun, LU Zhaoxin, LU Mingsheng, et al. Identification of archaeon-producing hyperthermophilic alpha-amylase and characterization of the alpha-amylase[J]. Microbiololy and Biotechnology, 2008, 80 (4): 605-614.

[8]張曉宇, 艾志錄，李夢琴, 等. 極限糊精酶的研究進展及展望[J]. 中國食品添加劑, 2004(3): 32-35.

[9]BERTOLDO C, ANTRANIKIAN G. Starch-hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacteria[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2002, 6(2): 151-160.

[10]唐寶英, 朱曉慧, 劉佳. 耐酸耐熱普魯蘭酶菌株的篩選及發酵條件的研究[J]. 微生物學通報, 2001, 28(1): 39-43.

[11]JOLIVET E, CORRE E, L HARIDON S, et al. Thermococcus marinus sp. nov., and Thermococcus radiotolerans sp. nov., two hyperthermophilic archaea from deep-sea hydrothermal vents that resist ionizing radiation[J]. Extremophiles, 2004, 8(3): 219-227.

[12]薩姆布魯克J, 拉塞爾 D W. 分子克隆實驗指南[M]. 3版, 黃培堂,譯. 北京: 科學出版社, 2002.

[13]楊云娟. 普魯蘭酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的高效表達[D]. 云南: 云南師范大學, 2005.

[14]夏子芳, 王正祥. Thermotoga maritima普魯蘭酶的基因克隆與酶學性質研究[J]. 食品與發酵工業, 2007, 33(4): 19-22.

[15]KIM J, KIM Y, LEE H, et al. Molecular cloning and biochemical characterization of the first archaeal maltogenic amylase from the hyperthermophilic archaeon Thermoplasma volcanium GSS1[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 24: 661-669.

Cloning and Expression of a New Thermostable Pullulanase Gene from a Deep-sea Archaeaon Strain Thermococcus siculi HJ21

WANG Shu-jun1，LU Ming-sheng1，LI Hua-zhong2，XU Jin-li1,2，JIAO Yu-liang1，FANG Yao-wei1，LIU Shu1
(1. College of Food Science and Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The gene of pullulanase was amplified from Thermococcus siculi HJ21 with degenerate primes designed based on the NCBI published conserved sequence information. The DNA sequencing and BLAST (NCBI) analysis showed that this DNA sequence was a new pullulanase gene with an open reading frame (ORF) of 4056 bp in length encoding 1351 amino acids．The gene was cloned into the expression vector, pET28a, producing a hybrid plasmid pET28a-pull. Subsequently, pET28a-pull was introduced into Escherichia coli BL21(DE3). The lysate of the transformant cells showed thermostable pullulanase activity. The SDS-PAGE analysis showed a band with apparent molecular weight of 150 kD.

Thermococcus siculi HJ21；pullulanase；gene；PCR

Q936；Q814

A

1002-6630(2010)19-0309-04

2010-06-08

國家自然科學基金項目(40746030)；江蘇省高校自然科學研究重大項目(09KJA170001)

王淑軍(1965—)，女，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：shujunwang86@hotmail.com