凡納濱對(duì)蝦過(guò)敏原酶法消減技術(shù)的研究

吳海明，胡志和*

凡納濱對(duì)蝦過(guò)敏原酶法消減技術(shù)的研究

吳海明，胡志和*

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦肉水解，消減其過(guò)敏原。通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)過(guò)敏原消減情況進(jìn)行檢測(cè)，以492nm波長(zhǎng)處的OD值為指標(biāo)確定最佳水解條件。結(jié)果表明：胰蛋白酶最佳水解條件為：pH8.0、酶與底物質(zhì)量比1:100、水解溫度45℃、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解時(shí)間3h，水解物OD值為0.085；木瓜蛋白酶最佳水解條件為pH6.5，酶與底物質(zhì)量比1:100、水解溫度為60℃、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解時(shí)間3h，水解物OD值為0.049。

凡納濱對(duì)蝦；過(guò)敏原消減；酶聯(lián)免疫

過(guò)敏反應(yīng)又稱為變態(tài)反應(yīng)，是指機(jī)體受到抗原(包括半抗原)刺激后，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體再次接觸同一種抗原后在體內(nèi)引起體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，由此導(dǎo)致組織損傷或機(jī)體生理機(jī)能障礙[1]。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，有2.5%的成年人和6%～8%的兒童會(huì)對(duì)某些食品過(guò)敏[2]。美國(guó)有600～700萬(wàn)的過(guò)敏患者，每年平均有100～125例因食品過(guò)敏而致死的病例[3-4]。中國(guó)疾病控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在15～24歲年齡段的健康人群中，約有6%的人曾患有食品過(guò)敏疾病[5]。近年來(lái)有關(guān)食用或加工海產(chǎn)品導(dǎo)致過(guò)敏的報(bào)道層出不窮[6-11]，在聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織提出的八大類引起過(guò)敏的食物之中，蝦與蟹等甲殼類動(dòng)物及其制品是其中重要的一類[3-5]。蛋白酶能夠?qū)^(guò)敏原蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，破壞過(guò)敏原的抗原表位，從而降低過(guò)敏原的免疫活性。通過(guò)篩選出高效專一性的酶對(duì)過(guò)敏原進(jìn)行定向酶解，可以有效的降低過(guò)敏原[12-14]。本實(shí)驗(yàn)以凡濱納對(duì)蝦為研究對(duì)象，用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶凡納濱對(duì)蝦蝦肉進(jìn)行水解，通過(guò)間接酶聯(lián)免疫技術(shù)對(duì)水解后過(guò)敏原消減的程度進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于天津市老板娘水產(chǎn)城，為活品。海蝦過(guò)敏人血清(臨床癥狀均為喉嚨癢，嚴(yán)重時(shí)全身腫)和海蝦非過(guò)敏人血清都取自天津商業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，血清均放在－25℃的冰箱中凍存。

胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、HRP標(biāo)記的羊抗人IgE抗體(A9667) 美國(guó)Sigma公司；其他試劑無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PB-10普及型pH計(jì) Sartorius公司；KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；MODUL YOD-230型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo公司；FA1104N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī) 常州國(guó)華電器有限公司；RT-6000型酶標(biāo)分析儀 深圳雷社生命科學(xué)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 間接酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法[15]

包被抗原時(shí)為減小誤差每6孔作為一組，每板有1組做空白，在酶標(biāo)板中每孔加入100μL待測(cè)物后4℃放置過(guò)夜后用洗滌液(PBST)洗滌3次，每次5min，在濾紙上拍干后每孔加入封閉液(含質(zhì)量濃度為1g/100mL BSA的PBST)200μL，37℃水浴2h。封閉結(jié)束后，同樣用洗滌液洗滌3次，每次5min，拍干后每孔加一抗(含1g/100mL BSA的PBST將海蝦過(guò)敏人血清稀釋20倍) 100μL，37℃水浴2h后洗滌，拍干后加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgE(含1g/100mL BSA的PBST將二抗稀釋300倍)37℃水浴2h后洗滌，拍干后每孔加入100μL鄰苯二胺底物液室溫放置15min，每孔加入50μL終止液(2mol/L H2SO4)后在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值。

以組織搗碎勻漿后的蝦肉作為水解的底物，對(duì)水解后的凡納濱對(duì)蝦蝦肉凍粉進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)用未水解的蝦肉凍干粉作為陽(yáng)性對(duì)照，用正常人血清為一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉試驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.2.1 胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉單因素試驗(yàn)

溫度對(duì)酶解后過(guò)敏原活性影響：采用底物質(zhì)量濃度10g/100mL、酶與底物質(zhì)量比1:100、pH8.0的條件水解，改變水解溫度(35、40、45、50℃)；底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解后過(guò)敏原活性影響：采用溫度45℃、酶與底物質(zhì)量比1:100、pH8.0的條件水解，改變底物質(zhì)量濃度(5、10、15、20g/100mL)；酶與底物質(zhì)量比對(duì)酶解后過(guò)敏原活性的影響：采用溫度45℃、底物質(zhì)量濃度10g/100mL、pH8.0的條件水解，改變酶與底物質(zhì)量比(1:50、1:100、1:200、1:500)。

1.3.2.2 胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉正交試驗(yàn)條件的確定

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以溫度、底物質(zhì)量濃度和酶與底物質(zhì)量比為影響因素，以492nm波長(zhǎng)處的OD值(每組做6個(gè)平行，然后取均值)為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing trypsin hydrolysis

1.3.3 木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉試驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.3.1 木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉單因素試驗(yàn)

溫度對(duì)酶解后過(guò)敏原活性影響：采用底物質(zhì)量濃度10g/100mL、酶與底物質(zhì)量比1:100，pH6.5的條件水解，改變水解溫度(50、55、60、65℃)；底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解后過(guò)敏原活性影響：采用溫度60℃、酶與底物質(zhì)量比1:100、pH6.5的條件水解，改變底物質(zhì)量濃度(5、10、15、20g/100mL)；酶與底物質(zhì)量比對(duì)酶解后過(guò)敏原活性的影響：采用溫度60℃、底物質(zhì)量濃度10g/100mL、pH6.5的條件水解，改變酶與底物質(zhì)量比(1:50、1:100、1:200、1:500)。

1.3.3.2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉正交試驗(yàn)條件的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以溫度、底物質(zhì)量濃度和酶與底物質(zhì)量比為影響因素，以492nm波長(zhǎng)處的OD值(每組做6個(gè)平行，然后取平均值)為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing papain hydrolysis

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦試驗(yàn)條件的確定

2.1.1 胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦單因素試驗(yàn)

在用胰蛋白酶水解過(guò)程中水解pH值為8.0，水解時(shí)間為3h，控制水解溫度、底物質(zhì)量濃度和酶與底物質(zhì)量比3個(gè)參數(shù)的變化見(jiàn)表3。

由表3可知，用胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉，水解產(chǎn)物的OD值較陽(yáng)性對(duì)照的OD值(0.585)都有所降低。當(dāng)溫度不同時(shí)，溫度為45℃時(shí)，其水解產(chǎn)物OD值(0.176)較低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度不同時(shí)，底物質(zhì)量濃度為5g/100mL時(shí)，其水解產(chǎn)物的OD值(0.085)較低。當(dāng)酶與底物比不同時(shí)，1:100條件下水解產(chǎn)物OD值(0.176)較低。

表3 胰蛋白酶水解蝦肉單因素試驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 3 Experimental design and results in the single-factor investigation on trypsin hydrolysis (x±s)

2.1.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化水解條件結(jié)果

表4 胰蛋白酶水解蝦肉正交試驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 4 Experimental design and results in the orthogonal array investigation on trypsin hydrolysis (x±s)

由表4可知，通過(guò)胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦所得產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫檢測(cè)，得出3種因素對(duì)OD492nm值影響大小依次為C＞B＞A，即酶與底物比＞底物質(zhì)量濃度＞水解溫度，較好的實(shí)驗(yàn)方案為A2B1C2，即水解溫度45℃、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、酶與底物質(zhì)量比1:100，此條件下其OD492nm值為0.085。

2.2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.2.1 木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦單因素試驗(yàn)

在用木瓜蛋白酶水解過(guò)程中水解pH值為6.5，水解時(shí)間為3h，控制水解溫度、底物質(zhì)量濃度和酶與底物質(zhì)量比3個(gè)參數(shù)的變化見(jiàn)表5。

表5 木瓜蛋白酶水解蝦肉單因素試驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 5 Experimental design and results in the single-factor investigation on papain hydrolysis (x±s)

由表5可知，用木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉，水解產(chǎn)物的OD值較陽(yáng)性對(duì)照的OD值(0.585)都有所降低。當(dāng)溫度不同時(shí)，溫度為60℃時(shí)，其水解產(chǎn)物OD值(0.081)較低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度不同時(shí)，底物質(zhì)量濃度為5g/100mL時(shí)，其水解產(chǎn)物的OD值(0.049)較低。當(dāng)酶與底物比不同時(shí)，1:100條件下水解產(chǎn)物OD值(0.081)較低。

2.2.2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦正交試驗(yàn)法優(yōu)化水解條件結(jié)果

表6 木瓜蛋白酶水解蝦肉正交試驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 6 Experimental design and results in the orthogonal array investigation on papain hydrolysis (x±s)

由表6可知，通過(guò)木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦所得產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫檢測(cè)，得出3種因素對(duì)OD值影響大小依次為A＞C＞B，即水解溫度＞底物質(zhì)量濃度＞酶與底物質(zhì)量比，較好的實(shí)驗(yàn)方案為A2B1C2，即水解溫度為60℃，底物質(zhì)量濃度為5g/100mL，酶與底物質(zhì)量比為1:100，此條件其OD值為0.049，該值在正常人血清與抗體反應(yīng)的OD值的范圍內(nèi)。

3 結(jié) 論

采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉對(duì)其過(guò)敏原均有消減作用。但采用木瓜蛋白酶水解蝦肉，其過(guò)敏原的消減效果較好。其在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最優(yōu)條件為：酶與底物質(zhì)量比1:100、水解溫度60℃、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解時(shí)間3h，經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)其水解物OD值為0.049。該值在正常人血清與抗體反應(yīng)的OD值的范圍內(nèi)。

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Enzymatic Elimination of Allergens in Litopenaeus vannamei

WU Hai-ming，HU Zhi-he*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

To eliminate the allergens in Litopenaeus vannamei, the meat of this shrimp was hydrolyzed separately with trypsin and papain, and their respective hydrolysis conditions were optimized for achieving minimum optical density at 492 nm (OD492nm) in the indirect ELISA determination of allergen elimination. The optimal conditions for trypsin hydrolysis were determined as follows: pH 8.0; enzyme/substrate mass ratio 1:100; hydrolysis temperature 45 ℃; substrate concentration 5 g/100 mL; and hydrolysis duration 3 h, and the resultant OD492 nm value was 0.085. pH of 6.5, enzyme/substrate mass ratio of 1:100, hydrolysis temperature of 60 ℃, substrate concentration of 5 g/100 mL and hydrolysis duration of 3 h were found optimal for papain hydrolysis, and the minimum OD492 nm value under these conditions was as low as 0.049.

Litopenaeus vannamei；allergen elimination；ELISA

TS207.3

A

1002-6630(2010)19-0038-04

2010-06-27

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2008BAD94B09)

吳海明(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wuhaiming-22@163.com

*通信作者：胡志和(1962—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn