泰和烏骨雞活性肽的分離及其體外抗氧化作用

劉建華，田穎剛，王 勇，朱 勝，王春艷，張 盼，謝明勇*

泰和烏骨雞活性肽的分離及其體外抗氧化作用

劉建華，田穎剛，王 勇，朱 勝，王春艷，張 盼，謝明勇*

(南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

利用制備型HPLC對泰和烏骨雞活性肽進行分離，流動相為0.01mol/L的磷酸鹽溶液，采用強酸型離子交換樹脂和強堿型離子交換樹脂兩步脫鹽法對泰和烏骨雞活性肽各分離組分進行脫鹽處理。以肌肽和抗壞血酸為對照，通過清除羥自由基作用、抑制脂質(zhì)過氧化作用以及對Fe2+和Cu2+螯合能力4個體系測定泰和烏骨雞活性肽及其分離組分的體外抗氧化能力。結(jié)果表明：泰和烏骨雞活性肽分離所得13個組分均具有一定的抗氧化能力，且與質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系，絕大部分分離活性肽組分比活性總肽有更強的羥自由基清除能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力以及Fe2+螯合能力。

泰和烏骨雞活性肽；抗氧化；清除自由基；抑制脂質(zhì)過氧化；金屬螯合能力

活性氧和自由基不僅和人的衰老以及各種疾病如癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)紊亂有關(guān)[1-2]，而且還會造成脂類物質(zhì)的氧化，導致食品的變色、變味、營養(yǎng)損失甚至毒素形成。人工合成的抗氧化劑如BHA和BHT有優(yōu)良的抗氧化效果，但其潛在健康危害越來越受到消費者的關(guān)注[3]。近年來，生物活性肽因其具有抗高血壓、抗氧化、抗血栓、抗菌消炎及免疫調(diào)節(jié)等功能而備受科研工作者的關(guān)注。Kitts和Weiler將生物活性肽定義為：一類對人體機能和狀態(tài)有著積極影響并最終影響人體健康的一類特定蛋白質(zhì)碎片[4]。天然抗氧化肽是生物活性肽的一種，其分子質(zhì)量小，易吸收，可通過減少超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基，抑制脂質(zhì)過氧化以及螯合金屬離子等達到抗衰老的效果。Ren等[5]從草魚肉中水解得到天然抗氧化肽并得到活性最高的一級序列；Tang等[6]從玉米蛋白水解物中分離純化并鑒定得到具有較強抗氧化活性的四肽Leu-Met-Cys-His；Li等[7]研究鷹嘴豆蛋白水解物后發(fā)現(xiàn)其具有較強的還原能力、抑制亞油酸自氧化能力以及清除自由基能力。

泰和烏骨雞作為江西省重要的特色藥食資源，既是一種營養(yǎng)豐富的滋補食品，又是特有藥用雞種，被歷代醫(yī)家延用，歷史悠久，名揚中外。綜合大量醫(yī)藥文獻記載，烏骨雞不僅具有補肝腎、益血氣、退虛熱、調(diào)經(jīng)止帶、保肝等功能，而且可醫(yī)治心腹痛、虛損、崩中帶下、遺精、消渴、久痢、骨折、腰酸腿痛、風濕性關(guān)節(jié)炎、各種出血癥、紫癜、肝炎等疾病。本課題組通過大量研究后發(fā)現(xiàn)，泰和烏骨雞具有低脂肪、高磷脂含量及多不飽和脂肪酸、必需脂肪酸和花生四烯酸在脂肪酸組成中比例較高等特點[8-9]，另外還鑒定了烏骨雞有高含量的肌肽[10]，證明了烏骨雞總脂質(zhì)具有明確的補血作用[11]，黑色素為真黑色素具有抗氧化作用[12-13]，活性肽具有體外非酶糖基化抑制作用[14]。本實驗以肌肽和抗壞血酸為對照，深入研究泰和烏骨雞蛋白水解活性肽抗氧化活性，從清除羥自由基、抑制脂質(zhì)過氧化以及對Fe2+和Cu2+螯合作用等4個體系，探討活性肽及其制備液相分離所得13個組分的體外抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泰和烏骨雞活性肽：新鮮泰和烏骨雞，脫毛，去除內(nèi)臟，制成肉泥，采用木瓜蛋白酶酶解制得。強酸型離子交換樹脂(001×16)、強堿型離子交換樹脂(201×7)安徽三星樹脂科技有限公司；鄰菲羅啉、FeSO4、H2O2、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、Ferrozine、FeCl2、CuSO4、鄰苯二酚紫、肌肽和抗壞血酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV2800紫外-可見分光光度計 上海尤尼珂公司；FA1104電子天平 上海天平儀器廠；TDL-5-A離心機上海安亭科學儀器廠公司；HH24恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；AL-PHA1-2冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；Waters515二元高壓高效液相色譜儀、DeltaPrep 400制備型HPLC系統(tǒng) 美國Waters公司。Milli-Q超純水處理系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 泰和烏骨雞活性肽分離純化

分析型RP-HPLC色譜條件：烏骨雞活性肽質(zhì)量濃度：1mg/mL；流動相：0.01mol/L pH6.8 磷酸鹽溶液；色譜柱：Kromasil C18(4.6mm×250mm，5 μm)；流動相流速：1.0mL/min；進樣量：20μL；柱溫：27℃；檢測器：2996PAD；檢測波長：214nm。

制備型HPLC色譜條件：烏骨雞活性肽質(zhì)量濃度：50mg/mL；流動相：0.01mol/L pH6.8磷酸鹽溶液；色譜柱：Bondapak C18(30mm×300mm，15 μm)；流動相流速：18mL/min；進樣量：1000μL；柱溫：27℃；檢測器：2996PAD；檢測波長：214nm。

收集各組分，采用強酸型離子交換樹脂和強堿型離子交換樹脂兩步脫鹽法對泰和烏骨雞活性肽各分離組分進行脫鹽處理。方法如下：選用柱子(2.0cm×30cm)；裝柱(2.0cm×25cm)。首先按照GB/T 5476—1996《離子交換樹脂預處理方法》對兩種離子交換樹脂進行預處理，然后將各分離肽活性肽組分以5倍柱體積的流速(5～6mL/min)分別通過強酸型離子交換樹脂和強堿型離子交換樹脂，收集各脫鹽組分，濃縮至15mL，真空冷凍干燥，得各組分干粉備用。

1.3.2 羥自由基清除能力測定

[15]的方法，試驗設樣品組、空白組和對照組。樣品組試管中依次加入PBS緩沖液(pH7.4，0.4mol/L)、鄰菲羅啉溶液(2.5mmol/L)、樣品溶液、硫酸亞鐵溶液(2.5mmol/L)各1mL，H2O2溶液(20mmol/L，體積分數(shù)1%)0.5mL；空白組中用1mL去離子水代替樣品溶液；對照組中用1.5mL去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。反應在37℃恒溫水浴鍋中進行，準確反應1h后，快速記錄536nm波長處的吸光度。烏骨雞活性肽質(zhì)量濃度分別為0.1、1、10、50mg/mL；肌肽質(zhì)量濃度分別為0.1、1mg/mL；抗壞血酸質(zhì)量濃度分別為0.1、1mg/mL；烏骨雞活性肽13個分離組分質(zhì)量濃度均為10mg/mL。

按式(1)計算樣品對羥自由基的清除率：

式中：A1為空白組吸光度；A2為樣品組吸光度；A0為對照組吸光度。

1.3.3 抑制脂質(zhì)過氧化實驗

參考文獻[16]的方法，依次在10mL試管中加入0.5mL體積分數(shù)為10%的蛋黃懸液、0.1mL樣品溶液，然后用超純水補足至1mL。加入0.05mL FeSO4(0.07mol/L)，混勻反應30min以啟動脂質(zhì)過氧化。反應結(jié)束，再依次加入1.5mL 20%乙酸(pH3.5)和1.5mL 0.8g/100mL硫代巴比妥酸(含1.1g/100mL十二烷基硫酸鈉)，渦旋混勻，于95℃反應60min。冷卻后，加入5mL正丁醇，于3000r/min離心10min。取有機上相于532nm波長處測定其吸光度。烏骨雞活性肽質(zhì)量濃度分別為0.1、1、10、50mg/mL；肌肽質(zhì)量濃度分別為0.1、1mg/mL；抗壞血酸質(zhì)量濃度分別為0.1、1mg/mL；烏骨雞活性肽13個分離組分質(zhì)量濃度均為10mg/mL。空白組用等體積的超純水代替樣品。

按式(2)計算樣品對脂質(zhì)過氧化的抑制率：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.4 Fe2+螯合能力測定

參考Dinis等[17]的方法并略加改進。分別取1mL樣品溶液加入0.05mL FeCl2(2mmol/L)中，混勻后加入0.2mL Ferrozine (5mmol/L)試劑啟動反應，將混合物劇烈搖動混勻后于室溫下靜置10min，于562nm波長處測定溶液吸光度。烏骨雞活性肽質(zhì)量濃度分別為1、10、50mg/mL；肌肽質(zhì)量濃度分別為0.1、1mg/mL；抗壞血酸質(zhì)量濃度分別為0.1、1mg/mL；烏骨雞活性肽13個分離組分質(zhì)量濃度均為10mg/mL。空白組用等體積的超純水代替樣品。

按式(3)計算樣品對Fe2+螯合率：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.5 Cu2+螯合能力測定

參考文獻[18]的方法并略加改進。1mL樣品溶液與1mL 2mmol/L CuSO4溶液，1mL吡啶(pH7.0)，20μL 0.1%鄰苯二酚紫混合，反應5min后于632nm波長處測定吸光度。烏骨雞活性肽質(zhì)量濃度分別為1、10、50mg/mL；肌肽質(zhì)量濃度分別為0.1、1mg/mL；抗壞血酸質(zhì)量濃度分別為0.1、1mg/mL；烏骨雞活性肽13個分離組分質(zhì)量濃度均為10mg/mL。空白組用等體積的超純水代替樣品。

按式(4)計算樣品對Cu2+螯合率：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 泰和烏骨雞活性肽分離純化

反相液相色譜由于具有分辨率高、重復性好、回收率高等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)及多肽的分離分析中得到了極為廣泛的應用。通過對比用不同濃度的乙腈洗脫，超純水-甲醇、超純水-乙腈和超純水(0.1%三氟乙酸(TFA))-乙腈(0.1% TFA)梯度洗脫，以及不同濃度磷酸鹽溶液洗脫，得出用0.01mol/L pH6.8磷酸鹽溶液分離泰和烏骨雞活性總肽效果最好(如圖1a所示)。雖然在0～6min時活性肽并未完全分開，但是之后出現(xiàn)6個分離較為明顯的峰，所以選擇0.01mol/L pH6.8磷酸鹽溶液作流動相對泰和烏骨雞活性肽進行下一步制備型HPLC分離，見圖1b。泰和烏骨雞活性總肽被分離成約13個組分(組分9按保留時間收集)，其大致與分析型RP-HPLC分離譜圖相同，手動收集各組分。

圖1 泰和烏骨雞活性肽分析型(a)和制備型(b)HPLC分離色譜圖Fig.1 Analytical and preparative HPLC chromatograms of papainhydrolyzed Taihe Black-bone silky fowl muscle

2.2 羥自由基清除能力

表1 泰和烏骨雞活性肽不同體系下的抗氧化活性Table 1 Antioxidant effects of papain-hydrolyzed Taihe Black-bone silky fowl muscle, arnosine and ascorbic acid assessed using different simulated systems

圖2 泰和烏骨雞分離活性肽各組分羥自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ratios of 13 separated active peptide fractions at a concentration of 10 mg/mL

由表1可得出，泰和烏骨雞活性肽各質(zhì)量濃度對羥自由基均有清除作用，而且清除率與活性肽質(zhì)量濃度呈一定的量效關(guān)系。肌肽和抗壞血酸具有明顯的清除羥自由基作用，清除率與質(zhì)量濃度也呈一定的量效關(guān)系。當活性肽質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時，其清除率為7%，隨著質(zhì)量濃度的增大，活性肽羥自由基清除率從8.1% (1mg/mL)增加到18.6%(10mg/mL)和28.9%(50mg/mL)。而肌肽和抗壞血酸羥自由基清除率分別從0.1mg/mL時的9.4%和10.1%增加到1mg/mL時的20.3%和96.7%。特別是當質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時，活性肽、肌肽和抗壞血酸羥自由基清除率相差不大，分別為7%、9.4%和10.1%。然而只有當泰和烏骨雞活性肽質(zhì)量濃度達到10mg/mL時，才能達到肌肽1mg/mL時清除羥自由基的能力。根據(jù)圖2，在質(zhì)量濃度為10mg/mL時，泰和烏骨雞活性肽分離的13個組分對羥自由基均有清除作用，除組分6清除率為17.9%外，其余12個組分羥自由基清除率均比泰和烏骨雞活性總肽大(10mg/mL，18.6%，表1)。組分2清除率最大為29.7%，組分3、4次之，分別為29.47%和29.46%，均比50mg/mL時，烏骨雞活性總肽羥自由基清除率大(28.9%，表1)。組分7、9、12也有較強的羥自由基清除能力，清除率分別為27.1%、27.9%和27.1%。上述分析表明，泰和烏骨雞活性肽具有一定的清除羥自由基作用，且絕大部分分離組分清除羥自由基能力比活性總肽強。

2.3 抑制脂質(zhì)過氧化能力

圖3 泰和烏骨雞分離活性肽各組分脂質(zhì)過氧化抑制能力Fig.3 Lipid peroxidation inhibition capacities of 13 separated active peptide fractions at a concentration of 10 mg/mL

由表1得到，泰和烏骨雞活性肽各質(zhì)量濃度具有一定的抑制脂質(zhì)過氧化作用，且抑制率與活性肽質(zhì)量濃度呈一定的量效關(guān)系。肌肽和抗壞血酸具有明顯的抑制脂質(zhì)過氧化作用，抑制率與質(zhì)量濃度也呈量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度為10mg/mL以下，活性肽抑制脂質(zhì)過氧化能力較弱，分別為1.8%(0.1mg/mL)、6.6%(1mg/mL)和9.0% (10mg/mL)，當質(zhì)量濃度為50mg/mL時，活性肽脂質(zhì)過氧化抑制率迅速增至38.2%。在0.1mg/mL和1mg/mL時，質(zhì)量濃度對肌肽和抗壞血酸的抑制脂質(zhì)過氧化作用影響不大，但是這兩種對照均具有很強的抑制脂質(zhì)過氧化能力，分別從0.1mg/mL時的60.7%和73.7%增加到1mg/mL時的63.9%和78.0%。由圖3可知，在質(zhì)量濃度為10mg/mL時，泰和烏骨雞活性肽分離的13個組分具有明顯的抑制脂質(zhì)過氧化作用，在該質(zhì)量濃度下，13個組分抑制脂質(zhì)過氧化能力均比活性總肽強(10mg/mL，9.0%，表1)。組分7具有最強的脂質(zhì)過氧化抑制率為70.0%，組分2次之為62.2%。具有最小抑制作用的組分12脂質(zhì)過氧化抑制率為28.1%。上述分析表明，泰和烏骨雞活性肽具有一定的抑制脂質(zhì)過氧化作用，且其分離各組分抑制脂質(zhì)過氧化能力明顯強于活性總肽。

2.4 Fe2+螯合能力

圖4 泰和烏骨雞分離活性肽各組分Fe2+螯合能力Fig.4 Fe2+-chelating capacities of 13 separated active peptide fractions at a concentration of 10 mg/mL

由表1可以得出，泰和烏骨雞活性肽各質(zhì)量濃度具有一定的Fe2+螯合能力，且螯合率與活性肽質(zhì)量濃度呈明顯的量效關(guān)系。當活性肽質(zhì)量濃度為1mg/mL時，F(xiàn)e2+螯合率為8.5%，隨著質(zhì)量濃度的增大，F(xiàn)e2+螯合率增大到21.2%(10mg/mL)和41.1%(50mg/mL)。在0.1mg/mL和1mg/mL時，質(zhì)量濃度對肌肽Fe2+螯合率影響不大，但是在這兩個質(zhì)量濃度下肌肽具有較強的Fe2+螯合能力，螯合率分別為53.4%和57%。實驗中發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸不具有Fe2+螯合能力。由圖4可以看出，在質(zhì)量濃度為10mg/mL時，除組分4外，泰和烏骨雞活性肽分離的其余組分具有明顯的Fe2+螯合作用。組分7和組分2的Fe2+螯合率最低，分別為14.7%和20.3%，其余10個組分Fe2+螯合率均比同質(zhì)量濃度下烏骨雞活性總肽要高，組分10的Fe2+螯合率最高為58.6%，比50mg/mL時活性總肽以及1mg/mL時肌肽螯合率均更高。Fe2+螯合率力其次為組分9、12和13，螯合率分別為58.0%、54.7%和54.5%。上述分析表明，泰和烏骨雞活性肽具有一定的Fe2+螯合能力，且大部分分離組分的Fe2+螯合能力明顯強于活性總肽。

2.5 Cu2+螯合能力

圖5 泰和烏骨雞分離活性肽各組分Cu2+螯合能力Fig.5 Cu2+-chelating capacities of 13 separated active peptide fractions at a concentration of 10 mg/mL

由表1可以看出，泰和烏骨雞活性肽各質(zhì)量濃度具有一定的Cu2+螯合能力，且螯合率與活性肽質(zhì)量濃度呈明顯的量效關(guān)系。當活性肽質(zhì)量濃度為1mg/mL時，Cu2+螯合率為15.0%，隨著質(zhì)量濃度的增大，Cu2+螯合率增大到39.9%(10mg/mL)和58.3%(50mg/mL)。在0.1mg/mL和1mg/mL時，質(zhì)量濃度對肌肽Cu2+螯合率影響不大，在這兩個質(zhì)量濃度下肌肽具有較強的Cu2+螯合能力，螯合率分別為27.7%和31.2%，抗壞血酸的Cu2+螯合率從9.1%增大到75.4%。由圖5可以看出，在質(zhì)量濃度為10mg/mL時，除組分4和組分9外，泰和烏骨雞活性肽分離的其余組分均具有一定的Cu2+螯合作用，但螯合率均比相同質(zhì)量濃度下烏骨雞活性總肽要低。組分11的Cu2+螯合率最高為9.5%，其次為組分3、7和12，螯合率分別為6.4%、5.8%和5.7%。上述分析表明，泰和烏骨雞活性肽及其各分離組分具有一定的Cu2+螯合能力。

3 結(jié) 論

對物質(zhì)抗氧化機理的研究一般包括研究抗氧化劑是否具有還原能力，是否具有自由基清除能力，以及是否具有螯合過氧化金屬離子能力。本實驗通過清除羥自由基、抑制脂質(zhì)過氧化以及對Fe2+和Cu2+螯合能力4個體系的實驗，評價了泰和烏骨雞活性肽及其制備液相分離13個組分的抗氧化能力。實驗表明，泰和烏骨雞活性肽及其分離組分均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，與肌肽和抗壞血酸相比，其抗氧化能力相對較弱(個別分離活性肽組分除外)。但是，在相同質(zhì)量濃度條件下，絕大部分分離活性肽組分的抗氧化能力比總肽要強(Cu2+螯合能力除外)。由于C18柱分離使得相同或相近疏水性的多肽富集在一起，這些多肽具有較多相同的氨基酸側(cè)鏈，而多肽的抗氧化活性取決于氨基酸側(cè)鏈上的某些基團(如組氨酸的吲哚基團具有較強的抗氧化活性[19])，最終導致總體抗氧化能力增大。分離的各活性肽中抗氧化能力不完全一致，說明如果進一步分離純化，將可得到抗氧化活性較強、純度更高的活性肽。特別是，組分7具有較強的清除羥基自由基、抑制脂質(zhì)過氧化以及Cu2+螯合能力，但Fe2+螯合能力較弱，表明該組分抗氧化的機理可能是通過前3個體系表現(xiàn)出來。

本實驗研究表明，泰和烏骨雞活性肽具有一定的體外抗氧化能力，且其絕大部分分離組分抗氧化能力比烏骨雞活性總肽要高，雖然目前得到的烏骨雞活性肽抗氧化活性還不如肌肽和抗壞血酸，但是隨著進一步的分離純化，有可能找到具有更強抗氧化活性的活性肽組分。因此，泰和烏骨雞活性肽具備開發(fā)成一種天然抗氧化劑的潛力。

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Isolation and in vitro Antioxidant Activity of Active Peptides from Taihe Black-bone Silky Fowl (Gallus gallus domesticus Brisson) Muscle

LIU Jian-hua，TIAN Ying-gang，WANG Yong，ZHU Sheng，WANG Chun-yan，ZHANG Pan，XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The Taihe black-bone silky fowl muscle hydrolysate prepared by papain hydrolysis were separated to obtain active peptides by preparative HPLC with 0.01 mol/L phosphate buffer as the mobile phase, and the separated fractions were then pooled and desalted stepwise by 001×16 strong acid cation exchange resin and 201×7 strong basic anion exchange resin column chromatography. The hydrolysate and its separated fractions were tested for their in vitro antioxidant effects by hydroxyl free radical scavenging array, lipid peroxidation inhibition assay and measuring the ability to chelate Fe2+and Cu2+and compared with carnosine and ascorbic acid. Totally 13 fractions were separated from the Taihe black-bone silky fowl muscle hydrolysate, and all of them had obvious antioxidant effect in a concentration-dependent way. Most of the fractions presented stronger abilities to scavenge hydroxyl free radicals, inhibit lipid peroxidation and chelate Fe2+than the hydrolysate.

active peptides derived from Taihe black-bone silky fowl muscle；antioxidation；free radical scavenging ability；peroxidation inhibition；metal chelating ability

R282.74

A

1002-6630(2010)19-0079-05

2010-06-19

國家自然科學基金項目(20862012)

劉建華(1982—)，男，博士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物及功能食品開發(fā)。E-mail：liuin82@yahoo.com.cn

*通信作者：謝明勇(1957—)，男，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail：myxie@ncu.edu.cn