白術多糖對益生菌的促生長作用及結構分析

劉麗莎，王 銳，旭日花，尚 楠，王 洋，樊 秦，李平蘭*

白術多糖對益生菌的促生長作用及結構分析

劉麗莎，王 銳，旭日花，尚 楠，王 洋，樊 秦，李平蘭*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

對白術、枸杞、太子參、五味子、黨參、地黃、陳皮、靈芝的篩選結果表明，白術浸提液對嬰兒雙歧桿菌體外促生長效果最為明顯。白術經水提(1:20)、醇沉(1:3)、透析(3500D)、脫蛋白(Saveg法)后經DEAE陰離子交換柱層析分離得到中性白術多糖(AMP)。AMP對兩大類益生菌的促生長結果表明：AMP具有良好的促生長效果，其中對嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolesentis)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的促生長效果最佳，且AMP的促生長作用與其添加濃度有關。AMP經紅外光譜分析具有多糖特征吸收峰；經多角度激光散射儀結合凝膠滲透色譜(GPC-MALLS)法測得其重均分子質量(Mw)為5527g/mol，分子質量分布(Mw/Mn)為1.726；酸水解法及高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(HPAEC-PAD)分析表明：AMP為雜多糖，單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，其物質的量比為13.8:11.8:70.2:4.1。

白術多糖；促生長作用；分子質量；單糖組成；益生菌

白術(Atractylodes macrocephala Koidz)為菊科(Compositae)植物白術的干燥根莖，性溫，味甘苦，具有補脾、益胃、燥濕、和中等功效，主要產于我國浙江、安徽等地。已有研究表明，白術有抗衰老、治療胃腸功能紊亂、抗腫瘤、免疫調節、抗菌消炎等諸多作用，這與白術中的多種生物活性成分有關[1]。目前白術活性成分的研究主要集中在蒼術酮和白術內酯類方面，少數報道了白術多糖可以增加溶血素及調節脾淋巴細胞作用[2]，但沒有關于白術多糖對益生菌的作用方面的報道。

本研究旨在從常見藥食同源性中草藥中篩選出對雙歧桿菌具有良好促生長作用的中草藥，并對該中草藥的多糖進行提取純化，結構分析及體外促生長研究，為研制與開發新型功能性益生元提供新的思路與途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白術、枸杞、太子參、五味子、黨參、地黃、陳皮、靈芝均購自北京同仁堂百旺山藥店。

青春雙歧桿菌CICC6070(Bifidobacterium adolesentis)、嬰兒雙歧桿菌CICC6069(Bifidobacterium infantis)、長雙歧桿菌CICC6068(Bifidobacterium longum)購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；兩歧雙歧桿菌1.5091(Bifidobacterium bifidum)購自中科院微生物研究所；動物雙歧桿菌01(Bifidobacterium animalis)、嗜酸乳桿菌2La-12(Lactobacillus acidophilus)、植物乳桿菌T1-1(Lactobacillus plantarum)為中國農業大學食品科學與營養工程學院微生物實驗室保存菌株。

L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖(純度≥99%) Sigma公司；NaOH Dionex公司；Millipore超純水，其他試劑均為國產分析純。1.2儀器與設備

DIONEX ICS-3000高效離子色譜儀 美國戴安公司；HITACHI L-2000型凝膠滲透色譜儀 日本日立公司； DAWN HELEOS-II型激光光散射儀、Optilab rEX型示差折光儀 美國懷雅特技術公司；NEXUS-470傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計 尤尼柯公司；DHL-A電腦恒流泵、TH-500梯度混合器、BS-100A自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠公司；ML54/02電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；玻璃離子交換柱(2.6cm×20cm)填裝DEAE-Sepharose Fast Flow、玻璃凝膠過濾柱(1.6cm× 80cm)填裝Sepharose CL-6B Pharmacia公司； FD-1D冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 益生中草藥篩選

1.3.1.1 中草藥浸提液及其促生長培養基制備

各取10g中草藥，分別加入200mL蒸餾水浸泡24h，煎煮30min后過濾，濾渣加同量水再煎30min，合并濾液蒸發濃縮至100mL得到8種10%中草藥浸提液，按體積比1:9加入液體MRS培養基中，充氮后121℃滅菌20min置于冰箱備用[3]。

1.3.1.2 不同中草藥浸提液對雙歧桿菌的增殖作用

將活化好的B. infantis分別按1%(約106CFU/mL)的接種量接種于含不同中草藥浸提液的培養基中，同時以不加藥液的MRS培養基為對照，37℃培養12h后，進行樣品10倍系列梯度稀釋至合適濃度，采用Hungate厭氧滾管技術[4]，37℃培養48h后計數。

1.3.2 白術多糖的提取純化及純度鑒定

1.3.2.1 水提醇沉法制備白術粗多糖

將白術浸提液(制備方法見1.2.1.1節)濃縮后加入3倍體積的95%的乙醇，置于4℃冰箱醇沉過夜，8000r/min離心10min收集沉淀，沉淀復溶后，對水透析48h，除去乙醇、小分子糖、蛋白質、鹽等。濃縮透析液，真空冷凍干燥，得白術粗多糖。

1.3.2.2 Saveg法除蛋白[5]

白術粗多糖熱水復溶后，將Saveg液(氯仿與正丁醇體積比4:1)與糖液以2:1體積比混合搖勻脫蛋白，重復4次，至紫外測定在260、280nm波長處無蛋白質和核酸的吸收峰。糖液對水透析48h，除去氯仿和正丁醇，濃縮，冷凍干燥得到不含蛋白質的白術多糖。

1.3.2.3 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱層析純化

將除蛋白后的白術多糖配制成10mg/mL溶液，0.45μm微孔濾膜過濾后上樣，50mmol/LTris-HCl和0～1.0mol/L Tris-HCl-NaCl線性梯度混合洗脫，流速4.0mL/min，2min/管，收集40管，部分收集器收集洗脫液。以苯酚-硫酸比色法[6]跟蹤檢測每管多糖含量。收集含多糖的峰對去離子水透析24h，濃縮后冷凍干燥，得到白術多糖純品并命名為AMP(Atractylodes macrocephala polysaccharides)。

1.3.2.4 多糖純度鑒定

常壓凝膠色譜層析：將AMP凍干樣品復溶，配制成10mg/mL溶液，0.45μm微孔濾膜過濾后上樣，0.05mol/L NaCl洗脫，流速30mL/h，12min/管，自動部分收集器收集洗脫液。苯酚-硫酸比色法跟蹤檢測每管多糖含量，繪制曲線圖。

紫外(UV)檢測：將純品AMP制備成0.5mg/mL樣品待測液，以去離子水為空白對照，在波長220～580nm范圍內利用紫外分光光度計進行紫外全波長掃描，以確定AMP中是否含有核酸和蛋白質。

1.3.3 白術多糖對雙歧桿菌體外促生長實驗

1.3.3.1 白術多糖對雙歧桿菌體外生長的影響

將活化好的5株雙歧桿菌分別以1%接種量(約106CFU/ mL)接種于AMP，添加量為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的MRS培養基中，各添加量重復3組，37℃培養24h后，于600nm波長處測定各培養液的OD值。

1.3.3.2 白術多糖對乳桿菌的體外生長影響

將活化好的2株乳桿菌分別以1%接種量(約106CFU/mL)接種于AMP，添加量為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的MRS培養基中，各添加量重復3組，37℃培養24h后測定OD600nm。

1.3.4 白術多糖的結構分析

1.3.4.1 分子質量測定

多角度激光散射儀結合凝膠滲透色譜(GPC/MALLS)法檢測AMP重均分子質量。色譜條件：色譜柱Shodex OHpak SB-806M HR (8.0mm×300mm)；檢測器：激光光散射儀、示差折光儀；dn/dc值為0.135；流動相：0.1mol/L NaNO3；流速：0.5mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：200μL；樣品質量濃度：0.2mg/mL。

1.3.4.2 紅外光譜分析

采用KBr壓片法，NEXUS-470 FTIR紅外檢測器在400～4000cm-1檢測范圍掃描32次。

1.3.4.3 單糖組成測定

準確稱取AMP純品干粉5mg，加入200μL 濃H2SO4靜置，添加800μL蒸餾水，100℃恒溫水解2.5h，冷卻后定容至2mL，水解液以固體BaCO3中和，離心除去雜質，將上清液稀釋20倍并過濾后進行單糖定性檢測。

選擇不同質量濃度(0.2、0.5、1.0、4.0、10.0μg/mL)的混合單糖標準品，以單糖濃度(μg/mL)為橫坐標，以峰面積(nC×min)為縱坐標繪制每種單糖的標準曲線進行單糖定量檢測。

HPAEC-PAD色譜條件：糖分析柱(CarboPacTMPA10，4mm×250mm)；糖保護柱(CarboPacTMPA10，4mm×50mm)；流動相：H2O和200mmol/L NaOH，線性梯度洗脫；ED50A電化學檢測器；進樣體積：25μL；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃。

2 結果與分析

2.1 益生中草藥的篩選

不同中草藥浸提液按1.0%添加到MRS培養基中，對B. infantis生長影響的結果見圖1。

圖1 1.0%中草藥浸提液對B. infantis 體外生長的影響Fig.1 Promoting effects of 1.0% water extracts from eight common medicinal and edible Chinese herbs on the growth of B. infantis

圖1 顯示，8種中草藥浸提液對B. infantis生長的影響有較大差異，其中白術浸提液的促生長效果最為明顯，與空白對照相比，達到了極顯著水平(P＜0.01)；而枸杞、五味子則有一定的抑制作用，其余中草藥浸提液對B. infantis生長無明顯促進作用(P＞0.05)，這可能與藥液添加濃度、處理方式及受試菌株有關。

許多研究報道中草藥浸提液及中草藥多糖可以促進雙歧桿菌的增殖[7-9]，但到目前為止，還沒有關于白術多糖對益生菌促生長作用的報道。因此，本研究進一步分離純化該白術多糖，并對其促生長作用進行考察與驗證。

2.2 白術多糖提取純化

白術浸提液經水提醇沉后獲得粗多糖，得率為1g/10g白術，呈灰白色，片狀或粉末狀，水溶性良好。粗多糖經DEAE Sepharose F F柱層析(Tris-HCl和Tris-HCl-NaCl線性梯度混合洗脫)結果見圖2。

圖2 白術多糖的DEAE陰離子交換柱洗脫曲線Fig.2 Elution profile of crude polysaccharides from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae on DEAE Sepharose FF column

由圖2的DEAE陰離子交換柱洗脫曲線可以看出，白術粗多糖在Tris-HCl洗脫時得到一個中性多糖洗脫峰，峰形單一對稱，將此峰命名為AMP。

2.3 純度鑒定

采用常壓凝膠色譜層析和紫外檢測對AMP的純度進行鑒定，結果見圖3、4。

圖3 AMP的Sepharose CL-6B凝膠層析洗脫曲線Fig.3 Elution profile of the neutral polysaccharide fraction of crudepolysaccharides from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae on Sepharose CL-6B column

圖3 顯示，AMP經Sepharose CL-6B分子篩柱層析，苯酚-硫酸法跟蹤多糖含量時在26～35管處得到一峰，峰形單一對稱，無雜峰，表明經此方法純化獲得的白術多糖為均一多糖。

圖4 AMP的紫外掃描圖Fig.4 UV scanning spectrum of the purified neutral polysaccharide from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae

從圖4對白術多糖進行的紫外全波長掃描(220～580nm)結果可以看出，白術多糖在280nm附近沒有蛋白質的特征吸收峰，在260nm附近沒有核酸特征吸收峰，說明該多糖中不含蛋白質和核酸。

2.4 白術多糖對益生菌促生長作用

2.4.1 不同添加量白術多糖對雙歧桿菌促生長作用

圖5 不同添加量AMP對雙歧桿菌生長的影響Fig.5 Effect of amount of the purified neutral polysaccharide from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae added to medium on the growth of Bifidobacterium

由圖5可知，隨著AMP添加量的增加，B. adolescentis、B. infantis和B. animalis的生長表現為逐漸增加的趨勢，在2.0%添加量時達到了飽和，其中對B. adolescentis、B. infantis的促生長效果尤為顯著。當AMP添加量高于2.0%時，促生長效果反而減弱，這可能是由于高濃度的糖引起了滲透壓、pH值改變及代謝產物的積累等限制了雙歧桿菌的生長。而不同添加量的AMP對B. longum及B. bifidum的促生長作用均不顯著，促進效果不明顯。

2.4.2 不同添加量白術多糖對乳桿菌的促生長作用

圖6 不同添加量AMP對乳桿菌生長的影響Fig.6 Effect of amount of the purified neutral polysaccharide from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae added to medium on the growth of Lactobacillus

由圖6可知，AMP對2株乳桿菌的促生長作用與其添加量密切相關。在2.0%的添加量范圍內，隨著AMP添加量的增加，對L. plantarum的促生長作用顯著增強，添加量為2.0%時達飽和。但對L. acidophilus而言，僅在1.0%的范圍內，促生長效果隨AMP添加量增加而增強，但明顯低于對L. plantarum的促生長效果。2.5AMP摩爾質量測定

表1 白術多糖AMP的摩爾質量Table 1 Results of determining the neutral polysaccharide from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae by GPC-MALLS

由表1可知，AMP的Mw為5.527×103g/mol，Mn為3.203×103g/mol，Mw/Mn比值為1.726。Mw/Mn比值為多糖摩爾質量多分散系數(d)，其大小可作為判斷樣品摩爾質量分布是否均勻的指標。如果樣品分子大小比較均一，d值應比較小或接近1.0，本結果顯示AMP的d值為1.726，說明AMP的摩爾質量分布較均一。

池玉梅等[10]將水提醇沉后經DEAF纖維素柱分離得到的兩個水溶性白術多糖，經高效液相(HPLC)測得平均相對分子質量分別為1.36×105和1.04×105。梁中煥等[1]將Sephadex G-75層析柱制得的水溶性白術粗多糖經HPLC測得相對分子質量為8374。黃海英[11]用HPLC法測得生白術中性多糖相對分子質量為5896.43。侯軒等[12]采用復合酶法提取白術多糖經DEAE纖維素柱層析純化后經凝膠滲透色譜法測得其重均分子質量(Mw)為4360 D。而本實驗分離純化的白術多糖(AMP)重均分子質量為5527g/mol。

2.6 AMP紅外光譜

圖7 白術多糖AMP的FT-IR譜圖Fig.7 FT-IR spectrum of the neutral polysaccharide from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae

由圖7可知，3382.28cm-1處的極強而寬的吸收峰歸屬于羥基，是O－H伸縮振動峰；2934.83cm-1和2885.03cm-1處的中強峰是C－H伸縮振動峰；1453.98cm-1處是C－H彎曲振動峰；在1114.67、1033.69cm-1和988.53 cm-1處的強峰是C－O伸縮振動峰，并表明糖環形式為吡喃糖苷；這些特征峰都是典型的多糖特征吸收峰，說明該物質為多糖類化合物；1633.10cm-1處的強吸收峰是C＝O鍵伸縮振動峰；1342.23cm-1處出現的是O－H鍵的彎曲振動峰；1280～1240cm-1處是環醚的不對稱伸縮振動峰。

2.7 AMP單糖組成

圖8 單糖標品(1.0g/mL)HPAEC-PAD色譜圖Fig.8 HPAEC-PAD chromatogram of standard monosaccharides

圖9 AMP的HPAEC-PAD色譜圖Fig.9 HPAEC-PAD chromatogram of the neutral polysaccharide from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae

由圖8、9可以看出，圖譜基線平穩，雜質干擾少，各單糖的分離效果好，峰型單一且對稱。根據標準譜圖和各單糖的回歸方程，得到了樣品的單糖組成和比例。結果顯示，AMP是一種雜多糖，主要含有阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖，并含有少量的甘露糖。阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的含量摩爾比為13.8:11.8:70.2:4.1。

目前已報道的白術多糖都是雜多糖，單糖組成中通常含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖中的3～4種單糖。池玉梅等[10]分離得到的兩個水溶性白術多糖中，一個由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖組成；另一個由木糖、阿拉伯糖、半乳糖組成。梁中煥等[1]報道的白術水溶性多糖的單糖組成為葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖，物質的量比為7.36:1.00:3.05:1.52。本實驗中AMP由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和少量甘露糖組成，其中葡萄糖的含量較高，與已報道的白術多糖的單糖組成結果不完全一致，這也有可能與該白術的來源和分離純化方法不同有關。

3 結 論

本研究從8種中草藥中篩選出具有明顯益生作用的白術，并從中分離提取了活性成分白術多糖(AMP)，分析測定了AMP的分子質量與單糖組成等結構特點，考察了AMP對益生雙歧桿菌和乳桿菌的促生長效果。結果表明AMP是一個雜多糖，由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和少量甘露糖組成，在MRS培養基中以2.0%的添加量加入后，對B. adolescentis、B. infantis、B. animalis和L. plantarum具有明顯的促生長效果；1.0%的添加量對L.acidophilus具有良好的促生長作用。顯示出該AMP具有作為新型益生元開發的巨大潛力和應用前景。

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Promoting Effect of Polysaccharides Isolated from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae on the Growth of Probiotics and Structure Analysis

LIU Li-sha，WANG Rui，XU Ri-hua，SHANG Nan，WANG Yang，FAN Qin，LI Ping-lan*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Among eight common medicinal and edible Chinese herbs, namely Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Fructus Lycii Chinensis, Radix Pseudostellariae, Fructus Schisandrae Chinensis, Radix Codonopsitis, Radix Rehmanniae, Pericarpium Citri Reticulatae and Glossy Ganoderma), the water extract from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae had the most obvious promoting effect on the in vitro growth of Bifidobacterium infantis. A neutral polysaccharide fraction was obtained from Rhizoma Atractylodis Macrocephalae after water extraction (1:20 raw material/water ratio), absolute ethanol precipitation (1:3 concentrated crude extract/absolute ethanol), dialysis (through a membrane with a molecular weight cut-off of 3500 D), Sevag deproteinization and DEAE anion exchange column chromatographic separation. The polysaccharide fraction had a promoting effect on the growth of Bifidobacterium and Lactobacillus, especially on B. infantis, B. animalis, B. adolescentis and Lactobacillus plantarum in a concentration-dependent fashion. The infrared spectral analysis showed that the fraction had characteristic absorption peaks of polysaccharides, and its weight-average molecular weight (Mw) was measured to be 5527 g/mol using GPC coupled with a multiangle laser light scattering photometer (GPC-MALLS) and its molecular weight distribution (Mw/Mn) was 1.726. The analysis using acidic hydrolysis followed by high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) revealed that the polysaccharide was a hetero polysaccharide and its monosaccharide composition consisted of rabinose, galactose, glucose and mannose in a molar ratio of 13.8:11.8:70.2:4.1.

Rhizoma Atractylodis Macrocephala polysaccharide；growth promoting effect；molecular weight；monosaccharide composition；probiotics

TS201.4；R282.6

A

1002-6630(2010)19-0124-05

2010-06-23

國家大學生創新性實驗計劃項目(091001924)；國家“863”計劃項目(2008AA10Z324)

劉麗莎(1989—)，女，本科生，研究方向為益生菌與益生元的開發與利用。E-mail：liulisha0616@sina.com *通信作者：李平蘭(1964—)，女，教授，博士，研究方向為食品微生物與發酵工程。E-mail：plli@sohu.com