南山楂葉黃酮抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基的作用

董華強，甄暢迪，張 毅，李 梅，劉富來，黃劍波

南山楂葉黃酮抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基的作用

董華強1，甄暢迪1，張 毅2，李 梅1，劉富來1，黃劍波1

(1.佛山科學技術學院食品科學系，廣東 佛山 528231；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510641)

目的：研究南山楂葉黃酮提取物(SZ)對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用和抗氧化活性。方法：檢測SZ對來源于酵母菌的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，并采用Lineweave-Burk雙倒數曲線研究其抑制機理；測定SZ對DPPH自由基的清除率，考察其抗氧化活性。結果：SZ對α-葡萄糖苷酶的抑制率可達到64.3%，屬于非競爭性抑制；對DPPH自由基的清除率可達52.8%，IC50值為0.57mg/mL。結論：SZ對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用和具有一定的抗氧化活性。

南山楂葉；黃酮；α-葡萄糖苷酶；抑制作用；抗氧化

山楂為薔薇科植物山里紅(C. pinnatifida Bunge var. major N. E. Br.)、山楂(C. pinnatifida Bge)或野山楂(C. cuneata Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果實。前兩種習稱北山楂，后一種習稱南山楂。除了果實，山楂葉也可入藥，用于活血化淤，理氣通脈[1]。2005年版《中國藥典》也正式收載山楂葉。近年來，用山楂治療心血管方面疾病的研究較多。葉希韻等[2-4]研究表明，山楂葉黃酮對防治糖尿病及其并發癥有積極的作用。1990年版中國藥典一部未將南山楂收入[5]，對南山楂的研究報道也很少。一些學者對此有不同看法，虞人榮[6]甚至認為南山楂的治療作用優于正品山楂。

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.20)是位于小腸黏膜上的寡糖水解酶，與餐后血糖水平升高密切相關[7]。阿卡波糖(acarbose)是臨床上廣泛應用的控制餐后血糖的有效藥物，其藥效機理就是抑制小腸黏膜的α-葡萄糖苷酶活性[8]。由于阿卡波糖存在明顯的副作用[9-12]，人們一直在尋找天然無副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑[13-15]。有報道從植物中提取分離得到一些天然α-葡萄糖苷酶抑制劑，沒有阿卡波糖等藥物的副作用[16]。本實驗對南山楂葉黃酮提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南山楂(C. cuneata Sieb. Et Zucc.)干葉購于廣東陽山縣城。

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、DPPH、對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷 美國Sigma公司；阿卡波糖(acarbose) 德國拜耳公司；95%乙醇、甲醇、乙酸乙酯均為分析純 上海化學試劑廠；茶多酚(TP，含量70%)、蘆丁(含量95%) 上海同田生物技術有限公司。1.2儀器與設備

UV-260紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；M2e 酶標儀(micro-plate reader) 美國Molecular device公司；HH數顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；TGL-16臺式離心機 長沙市平凡儀器儀表有限公司；旋轉真空蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 南山楂葉黃酮提取

稱取南山楂葉40g，粉碎后移入圓底燒瓶，加入500mL 80%乙醇溶液，置于75℃水浴鍋中回流2h，過濾并收集濾液。重復3次，合并濾液，揮干，得到粗提物。稱取粗提物約5g，用50mL的20%乙醇溶液溶解后，加入等體積的乙酸乙酯萃取兩次，合并兩次乙酸乙酯層萃取液，揮干，得到南山楂葉黃酮提取物(SZ)。黃酮提取率和提取物的黃酮純度分別按式(1)、(2)計算：

式中：m1為南山楂葉黃酮提取物中黃酮質量/g；m0為南山楂葉中黃酮質量/g；mz為南山楂葉黃酮提取物質量/g。

1.3.2 黃酮含量測定

1.3.2.1 標準曲線的繪制

取0.05g蘆丁，充分溶解于50mL無水乙醇，分別取溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，加蒸餾水定溶至5mL制成梯度濃度。在波長260nm處測定吸光度(A260nm)；以蘆丁質量濃度(ρ)為橫坐標、A260nm為縱坐標作標準曲線，得回歸方程：A260nm=5.623ρ＋0.2203，r＝0.9897。

1.3.2.2 樣品黃酮含量測定

測定樣品液的A260nm值，根據公式A260nm=5.623ρ+ 0.2203，計算出樣品黃酮含量。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶活性測定

參照文獻[17]的方法，略作修改。取60μL待測液于96孔酶標板中，加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液，搖勻后于37℃水浴保溫10min，50μL PNPG溶液搖勻，在37℃水浴中反應20min，加入160μL Na2CO3溶液中止酶促反應，置于405nm波長處測吸光度。由于SZ本身有顏色，因此每個樣品需要測定背景吸收，并對最終測定結果進行校正。每個樣品重復3次取平均值。抑制率按式(3)計算。

式中：Aj為樣品組吸光度；A0為空白對照組吸光度。

采用Lineweaver-Burk作圖法，對SZ抑制α-葡萄糖苷酶活性的機理進行分析。

1.3.4 清除DPPH自由基能力測定

參照文獻[17]方法，略作修改。以甲醇為溶劑，配制不同質量濃度的樣品溶液，吸取50μL待測液于96孔酶標板中，加入150μL DPPH溶液，搖勻，25℃條件下避光靜置30min，于波長517nm處測定吸光度。按式(4)計算DPPH自由基清除率。

式中：Q為DPPH自由基清除率；A0為不加試樣DPPH溶液的吸光度；At為加試樣反應后 DPPH 溶液吸光度。

以清除DPPH自由基達到穩定態50%清除率所需加入樣品的質量濃度為IC50，用以表示其抗氧化能力。

2 結果與分析

2.1 南山楂葉提取物的黃酮含量

按照前述黃酮提取分離和測定方法，得到SZ的黃酮含量為3.35%，純度為58.2%，提取率為86.9%。

2.2 SZ對α-葡萄糖苷酶活性的抑制

圖1 SZ對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.1 α-glucosidase inhibiting effect of the flavonoid-rich extract studied using acarbose and tea polysaccharide as the controls

由圖1可知，陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用很強，而SZ對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用也很明顯，茶多酚對α-葡萄糖苷酶活性也有一定抑制作用，但抑制率很低。在0.01～0.3mg/mL質量濃度范圍內，SZ對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈一定量效關系，抑制效果隨SZ質量濃度的增加相應增強，在0.3mg/mL時抑制率達到64.3%。

2.3 南山楂葉黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制機理

以不同質量濃度(0.2mg/mL和0.5mg/mL)SZ作為抑制劑，測定不同底物質量濃度α-葡萄糖苷酶酶促反應速率(V)，以1/[S]為橫坐標，1/V為縱坐標作Lineweave-Burk雙倒數曲線，結果如圖2所示。

圖2 南山楂黃酮提取物抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweave-Burk雙倒數曲線Fig.2 Lineweaver-Burk plot of inhibitory effect of the flavonoid-rich extract onα-glucosidase

由圖2可見，兩條不同質量濃度的SZ的Lineweave-Burk雙倒數曲線相交于X軸的負值區，呈現出較典型的非競爭性抑制劑特征，反應速率隨抑制劑質量濃度增大而變小，米氏常數保持不變，說明SZ對α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于非競爭性抑制。

2.4 南山楂葉黃酮提取物對DPPH自由基的清除效果

2.4.1 SZ清除率隨時間的變化

圖3 SZ對DPPH自由基的清除率隨時間的變化曲線Fig.3 Time courses of DPPH free radical scavenging effect of the flavonoid-rich extract and vitamin C

由圖3可見，SZ對DPPH自由基的清除率隨時間的延長而逐漸增大，在開始反應30min后，對DPPH自由基的清除率達到最大值51.5%。而VC對DPPH自由基的清除率在反應后20min已接近最大值，達到78.3%。說明在本實驗體系中，SZ具有一定的抗氧化能力，但清除DPPH自由基的速率比VC慢。

2.4.2 不同質量濃度SZ對DPPH的清除率和IC50值

由圖4可知，在0.1～1.2mg/mL范圍內，SZ對DPPH自由基的清除率隨質量濃度的增大而增大，呈現一定的量效關系，在1.2mg/mL時達到最大值52.8%，IC50值為0.57mg/mL。而VC在0.6mg/mL時清除率達到84.5%， IC50值為0.28mg/mL。可見，SZ具有一定的抗氧化活性。但無論最大抗氧化能力和達到一半最大抗氧化能力所需的質量濃度(IC50值)，都不如VC。

圖4 不同質量濃度SZ、VC對DPPH自由基的清除率Fig.4 Concentration dependence of DPPH free radical scavenging effect of the flavonoid-rich extract and vitamin C

3 結 論

3.1 SZ對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制活性，抑制率可達到64.3%，抑制機理屬于非競爭性抑制。

3.2 SZ具有明顯的清除DPPH自由基能力，清除率可達52.8 %，IC50值為0.57mg/mL。

綜上所述，SZ對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制活性，并具有一定的抗氧化能力，具有很好的抗糖尿病活性開發潛力，值得進一步深入研究。

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Alpha-glucosidase Inhibiting Effect of DPPH free Radical Scavenging Activity of Flavonoid-rich Extract from Leaves of Crataegus cuneata Sieb. et Zucc

DONG Hua-qiang1，ZHEN Chang-di1，ZHANG Yi2，LI Mei1，LIU Fu-lai1，HUANG Jian-bo1
(1. Department of Food Science, Foshan University, Foshan 528231, China；2. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

A flavonoid-rich extract obtained by ethyl acetate extraction from the 80% ethanol extract from the leaves of Crataegus cuneata Sieb. et Zucc was evaluated for its alpha-glucosidase inhibiting effect and DPPH free radical scavenging activity. The extract had an inhibitory effect on alpha-glucosidase derived from yeast, and the maximum inhibitory rate was up to 64.3%, and the inhibition was uncompetitive according to the Lineweaver-Burk plot. The maximum DPPH free radical scavenging rate of the extract was up to 52.8%, and the IC50 was 0.57 mg/mL. In conclusion, the extract had strong ability to inhibit yeast-derived alphaglucosidase and certain antioxidant activity.

leaves Crataegus cuneata Sieb. et Zucc；flavonoids；alpha-glucosidase；inhibiting effect；antioxidation

TS201.2

A

1002-6630(2010)19-0179-03

2010-07-05

廣東省自然科學基金項目(8152800001000023)

董華強(1958—)，男，教授，博士，研究方向為農產品貯藏與加工、食品功能性成分化學與活性評價。E-mail：huaqiangdong@163.com