香薷多糖的乙醇分級純化及其性質

李卷梅，聶少平*，李景恩，李 昌，謝明勇

香薷多糖的乙醇分級純化及其性質

李卷梅，聶少平*，李景恩，李 昌，謝明勇

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

采用熱水浸提法從香薷中得到多糖提取物，然后采用乙醇分級沉淀法純化香薷多糖，收集得到乙醇體積分數為20%、30%、40%、50%、60%、70%條件下析出的多糖沉淀物。之后經Sevag法脫除多糖中的游離蛋白，得到純化后的6個香薷多糖組分HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6。應用紫外和紅外光譜檢測HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的光譜性質，測定糖含量、可溶性蛋白質含量和糖醛酸含量，并用氣相色譜法測定單糖組成。結果表明：HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6均為酸性多糖，蛋白含量較高。HMP-1和HMP-2主要含有阿拉伯糖和葡萄糖，HMP-3主要含有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和核糖，HMP-4主要含有阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，HMP-5和HMP-6主要含有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖。此外，6個多糖組分均含有少量的鼠李糖、木糖，但單糖間物質的量比相差較大。

香薷多糖；乙醇分級沉淀；理化性質；光譜性質；單糖組成

香薷(Herba Moslae)為傳統的辛溫解表中藥，被衛生部列為藥食兩用資源目錄之中，全草能發汗解表，利水消腫，調中溫胃止嘔，最早記載于《名醫別錄》，列為中品，又名香柔[1]。香薷屬多年生草本，在我國分布廣泛，全國香薷類商品藥材主要為“江香薷”和“青香薷”[2]。過去香薷的化學成分研究僅限于揮發油成分，其揮發油具有解熱、陣痛、免疫增強、抗菌及抗病毒作用[3]。

江香薷是江西的地道藥材，栽培歷史悠久，主要分布于新余市、樟樹市、分宜縣、渝水區等地。目前國內外對香薷多糖的研究報道較少，本實驗對從江西樟樹產的江香薷用熱水浸提得到香薷多糖，采用乙醇分級沉淀法進行純化得到不同多糖組分，測定其糖含量、可溶性蛋白含量以及糖醛酸含量，結合紫外、紅外光譜考察其光譜性質，并用氣相色譜法分析其單糖組成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香薷采自江西省樟樹市中藥材市場，經鑒定為唇形科植物江香薷，粉碎后過20目篩。

D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖和L-巖藻糖 上海國藥試劑公司；牛血清白蛋白 Amersco公司；考馬斯亮藍G-250(進口分裝) Fluka公司；濃硫酸、無水乙醇、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、乙酸酐、吡啶、咔唑、苯酚、鹽酸羥胺、葡萄糖等均為國產分析純。1.2儀器與設備

ALPHA 1-2 冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；GC(6890N) 美國Agilent Technologies公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Nicolet FT-IR 5700型傅里葉紅外光譜儀 Thermo Electron 公司；AL 104電子天平 上海梅特勒-托利儀器公司；EYELAN-1001旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；SHZ-ⅢB循環水真空泵 上海亞榮生化有限公司；TDL-5型離心沉淀機 上海飛鴿系列離心機廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋 上海國華電器有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；透析袋(8000～10000D)美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 香薷多糖水提物的制備

稱取已粉碎過篩的香薷100g，用800mL 體積分數為80%的乙醇浸泡24h脫除脂溶性物質，雙層濾布過濾。濾渣置于50℃烘箱中揮干乙醇[4]。干燥后，加1500mL蒸餾水，于87℃水浴回流提取4h[5]，4800r/min離心分離10min，雙層濾布過濾。濾渣重復提取一次，合并濾液，旋轉蒸發濃縮，得到香薷多糖水提物。

1.3.2 香薷多糖的乙醇分級沉淀

將多糖水提物依次用體積分數為20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇于4℃層析冷柜中分級沉淀12h，離心，沉淀用無水乙醇洗滌兩次。自然風干乙醇后，用Sevag法[6](氯仿與正丁醇體積比為4:1)脫蛋白，反復進行兩次。然后用流動自來水透析48h，蒸餾水透析24h[7]，透析液濃縮后冷凍干燥得香薷多糖組分(HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6)，備用。

1.3.3 基本理化指標測定

以鼠李糖為標準，苯酚-硫酸法測定總糖含量[8]；以牛血清白蛋白為標準，考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量[9]；以半乳糖醛酸為標準，硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量[10]。

1.3.4 紫外光譜分析

將質量濃度為0.1mg/mL的多糖樣品溶液置于紫外-可見分光光度計中于190～400nm的波長范圍進行光譜掃描[11]。

1.3.5 紅外光譜分析

稱取干燥樣品1mg，與約100mg KBr研磨后，KBr封閉樣品顆粒，制成透明壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4000cm-1區內進行光譜掃描[12]。

1.3.6 單糖組成分析

稱取10mg樣品于安培管中，加入2mL濃度為2mol/L的三氟乙酸，真空封管，100℃下水解8h[13]。水解后，樣品冷卻至室溫，于70℃水浴用氮氣吹干三氟乙酸，得到多糖水解物。

稱取8種標準單糖(鼠李糖、核糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)各2mg于樣品管中，加入10mg鹽酸羥胺，0.5mL吡啶溶解。加塞，于90℃恒溫水浴振蕩30min。冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐。加塞，于90℃恒溫水浴振蕩30min[14]。冷卻至室溫，用有機膜過濾，得到糖腈乙酸酯衍生物。將多糖水解物按照相同方法進行衍生。氣相色譜儀工作參數見表1。

表1 氣相色譜儀工作參數Table 1 GC instrumental parameters

2 結果與分析

2.1 基本理化指標測定

由表2可知，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的糖含量均不高，最多為43.06%，最少為28.72%。HMP-2的糖醛酸含量最高，達到51.71%；HMP-5的糖醛酸含量最低，只有9.44%。除HMP-6，其余5個多糖組分的蛋白質含量均在11%～20%之間。由于用Sevag法基本脫除了游離蛋白，所以樣品中的蛋白質應為與多糖結合緊密的結合蛋白。HMP-2是得率最高的多糖組分，其中的雜質較少，糖、糖醛酸、蛋白質三者加起來含量超過96%。HMP-3的得率其次，其雜質含量也較少。因此，在后續實驗中將對HMP-2和HMP-3這兩個組分進行深入分析。其余組分的雜質較多，考慮為灰分和結合水。

表2 HMP化學組成分析Table 2 Chemical composition analysis of HMP-1 through 6

2.2 紫外光譜掃描

圖1 HMP紫外可見掃描光譜Fig.1 UV absorption spectra of HMP-1 through 6

由圖1可知，6種多糖在260nm波長處均沒有吸收峰，說明不含核酸成分；在280nm波長處略有吸收，且從HMP-1至HMP-6，280nm波長處吸收程度逐漸增大，這與用考馬斯亮藍染色法測得的蛋白含量趨勢一致。2.3紅外光譜掃描

圖2 HMP-1、HMP-2、HMP-3紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of HMP-1, 2 and 3

圖3 HMP-4、HMP-5、HMP-6紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of HMP-4, 5 and 6

紅外光譜可以進行一些復雜化合物的定性及定量分析，檢驗分子中一些官能團和氫鍵的存在。紅外光譜法不破壞樣品，這對于極難獲得的糖的微量樣品尤為重要[15]。6種多糖的紅外掃描結果見圖2、3。

在3400cm-1左右出現的寬峰為羥基的O－H伸縮振動或氨基的N－H伸縮振動[16]，O－H伸縮振動和N－H伸縮振動往往相互疊加，難以區分。若為O－H伸縮振動，則當部分羥基被取代時，該峰會減弱[15]。從HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6分別在3384.2、3419.4、3418.4、3421.0、3374.5、3381.0cm-1的吸收強度可以看出，HMP-1和HMP-6的羥基較多，其余4個組分的羥基較少。在2923cm-1附近(2927.9、2930.9、2932.3、2930.2、2930.1、2941.7cm-1)出現的弱吸收峰為糖環中的C－H伸縮振動[17]。1400～1200cm-1之間的吸收峰是糖類化合物的C－H變角振動。由此可以初步判定，6個組分均為多糖。

1650～1500cm-1之間的吸收峰是氨基的N－H變角振動[15]，由此證明6種多糖應該含有蛋白質。對于HMP-5和HMP-6，在1650～1500cm-1區域比其他組分多一個吸收峰，這可能由于其蛋白質含量較高引起。鑒于6種多糖在1650～1620cm-1之間均沒有吸收峰，因此它們應該不含有酰胺基。

在1410cm-1左右出現的吸收峰為羧基的C－O伸縮振動，在1320～1210cm-1之間的一組吸收峰為羧基的O－H變角振動[15]，由此可以判斷6種多糖含有羧基。值得注意的是，HMP-2在1741.1cm-1處有一吸收峰，這可能為乙酰酯基或醛基的C=O伸縮振動，而在之前的化學組成測定中發現HMP-2的糖醛酸含量最高，因此為醛基的C=O伸縮振動的可能性更大。

1200～950cm-1區域內比較大的吸收峰是由兩種C－O伸縮振動引起的，一種是屬于C－O－H的，另一種是屬于糖環C－O－C的[18]。HMP-1在1151.1cm-1和1026.7cm-1處的兩個吸收峰可能為果膠的吸收峰，而根據HMP-2在1741.1、1619.1、1103.0、1016.6cm-14處的吸收峰判斷該組分極有可能含有果膠[19]，這符合之前的糖醛酸測定結果。

HMP-1和HMP-2同時在767cm-1處出現的吸收峰是由對稱吡喃環的伸縮振動引起；HMP-2和HMP-3分別在910.4、906.8cm-1處的吸收峰應該是β-D-半乳吡喃糖的特征吸收；HMP-2在832.5cm-1處的峰可能是α-甘露吡喃糖或者β-阿拉伯吡喃糖的特征吸收；HMP-3在819.2cm-1處的峰可能是α-甘露吡喃糖的特征吸收或者呋喃環的C－H變角振動；HMP-4在898.8cm-1處的峰是β-D-甘露吡喃糖的特征吸收；HMP-5和HMP-6分別在782.3、807.8cm-1處的吸收峰應該為呋喃環的C－H變角振動[15]；HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-5和HMP-6在600cm-1附近的一組峰為O－H的面外振動[20]。

2.4 單糖組成

標準單糖衍生物的氣相色譜圖見圖4，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的單糖組成見表3。從圖4可以看出，除巖藻糖衍生物和阿拉伯糖衍生物沒有完全分離外，其他6種單糖衍生物得到較好分離。

圖4 標準單糖衍生物的氣相色譜圖Fig.4 GC chromatogram of monosaccharide standard derivatives

3 結 論

本研究首次用乙醇分級沉淀的方法純化香薷多糖并研究其理化性質。結果表明：HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6糖含量中等，均有一定量的糖醛酸和蛋白質，這與光譜分析結果一致。氣相色譜分析表明，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6主要含有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖，此外還有少量的甘露糖、木糖、鼠李糖和核糖。

[1]龔慕辛, 朱甘培. 香薷的本草考證[J]. 北京中醫, 1996(5): 39-41.

[2]胡珊梅, 范崔生, 袁春林. 江香薷的本草考證和藥材資源的研究[J].江西中醫學院學報, 1994, 6(2): 31-34.

[3]南京中醫藥大學. 中藥大辭典[M]. 2版. 上海: 上海科學技術出版社, 2006: 2348-2351.

[4]楊超, 李景恩, 邱增輝, 等. 香薷多糖的提取與純化研究[J]. 食品科學, 2009, 30(18): 99-101.

[5]李景恩, 聶少平, 楊超, 等. 響應曲面法優化香薷多糖的提取工藝[J].食品科學, 2009, 30(18): 131-134.

[6]WANG Chiachi, CHANG Shyhchung, CHEN Binghuei. Chromatographic determination of polysaccharides in Lycium barbarum Linnaeus [J]. Food Chemistry, 2009, 116: 595-603.

[7]朱曉霞, 羅學剛. 多糖提取與純化技術應用進展[J]. 食品研究與開發, 2007, 28(3): 186-189.

[8]李景恩, 聶少平, 楊美艷, 等. 香薷中多糖含量的測定[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 487-490.

[9]BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.

[10]BITTER T, MUIR H M. A modified uronic acid carbazole reaction[J]. Analytical Biochemistry, 1962, 4(4): 330-334.

[11]ZHAO Mouming, YANG Ning, YANG Bao, et al. Structural characterization of water-soluble polysaccharides from Opuntia monacantha cladodes in relation to their anti-glycated activities[J]. Food Chemistry, 2007, 105: 1480-1486.

[12]PARIKH A, MADAMWAR D. Partial characterization of extracellular polysaccharide from cyanobacteria[J]. Bioresource Technology, 2006, 97: 1822-1827.

[13]YU Rongmin, YIN Yin, YANG Wei, et al. Structural elucidation and biological activity of a novel polysaccharide by alkaline extraction from cultured Cordyceps militaris[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 75: 166-171.

[14]CHEN Yi, XIE Mingyong, NIE Shaoping, et al. Purification, composition analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Ganoderma atrum[J]. Food Chemistry, 2008, 107: 231-241.

[15]張惟杰. 糖復合物的生化研究技術[M]. 杭州: 浙江大學出版社, 1994.

[16]KUMAR C G, JOO H S, CHOI J W, et al. Purification and characterization of an extracellular polysaccharide from haloalkalophilic Bacillus sp. I-450[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 34: 673-681.

[17]YANG Cuixian, HE Ning, LING Xueping, et al. The isolation and characterization of polysaccharides from longan pulp[J]. Separation and Purification Technology, 2008, 63: 226-230.

[18]KACUR KOV M, CAPEK P, SASINKOV V, et al. FT-IR study of plant cell wall model compounds: Pectic polysaccharides and hemicelluloses[J]. Carbohydrate Polymers, 2000, 43: 195-203.

[19]KOST ALOVA Z, HROMADKOVA Z, EBRINGEROVA A. Isolation and characterization of pectic polysaccharides from the seeded fruit of oil pumpkin (Cucurbita pepo L. var. Styriaca)[J]. Industrial Crops and Products, 2010, 31: 370-377.

[20]CHIOVITTI A, BACIC A, CRAIK D J, et al. Cell-wall polysaccharide from Australian red algae of the family Solieriaceae(Gigartinales, Rhodophyta): Novel, highly pyruvated carrageenans from the genus Callophycus[J]. Carbohydrate Research, 1997, 299: 229-243.

Ethanol Fractional Precipitation and Characterization of Polysaccharides from Herba Moslae

LI Juan-mei，NIE Shao-ping*，LI Jing-en，LI Chang，XIE Ming-yong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

A polysaccharide-rich extract was obtained from Herba Moslae by hot water extraction and purified by fractional precipitation with gradient concentrations of ethanol (20%, 30%, 40%, 50%, 60% and 70%). The separated fractions were deproteinized by Sevag method and six purified polysaccharide fractions, named HMP-1 through 6 were obtained. These fractions were subjected to UV-visible spectral analysis, the determination of sugar, soluble protein and uronic acid contents and monosaccharide composition analysis by gas chromatography (GC). Each of these fractions was an acidic polysaccharide, with high protein content. Arabinose and glucose were the main monosaccharides in HMP-1 and HMP-2, arabinose, glucose, galactose and ribose were the main monosaccharides in HMP-3, arabinose, glucose and galactose were the main monosaccharides in HMP-4, and arabinose, glucose, galactose and mannose were the main monosaccharides in HMP-5 and HMP-6. In addition, small amounts of rhamnose and xylose were also detected in each of the six fractions.

polysaccharides from Herba Moslae；ethanol fractional precipitation；physico-chemical properties；spectral properties；monosaccharide composition

TQ929.2

A

1002-6630(2010)19-0182-04

2010-06-27

食品科學與技術國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200806)；江西省青年科學家井岡之星；遠航工程項目

李卷梅(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：lijuanmei_ncu@hotmail.com

*通信作者：聶少平(1978—)，男，副教授，博士，主要從事食品科學與工程、食品營養與安全及糖化學與糖生物學研究。E-mail：spnie@ncu.edu.cn