應用細胞模型研究蜂膠醇提物的抗氧化活性

吳正雙，董 捷，張紅城，趙亮亮，高文宏*

應用細胞模型研究蜂膠醇提物的抗氧化活性

吳正雙1,2，董 捷2，張紅城2，趙亮亮3，高文宏1,*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510641；2.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093；3.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150028)

為了研究蜂膠醇提物在細胞內的抗氧化活性(CAA)，本實驗將2′, 7′-二氯熒光二乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針裝載到人肝癌Hep G2細胞內，然后被進入到細胞內的2, 2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)產生的活性氧氧化成有熒光的二氯熒光(DCF)；以熒光值為指標，使用多功能酶標儀和熒光倒置顯微鏡分析蜂膠醇提物清除活性氧的能力。結果表明：蜂膠醇提物具有明顯的抗氧化活性，并呈現良好的劑量-效應關系。當CAA值達到50時，蜂膠醇提物質量濃度僅0.14mg/mL；當蜂膠醇提物質量濃度為0.5mg/mL時，細胞內的活性氧顯著減少，有綠色熒光的細胞數幾乎減少一半，清除率接近50%。蜂膠醇提物具有非常好的細胞內抗氧化能力。

人肝癌Hep G2 細胞；活性氧(ROS)；細胞內抗氧化

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是指化學性質活潑的氧代謝產物，包括超氧陰離子自由基、羥自由基、單線態氧和過氧化氫。活性氧在人體中發揮著重要作用，但過量的活性氧會對人體產生氧化損傷，導致細胞死亡，因此清除人體中過量的活性氧是十分重要的[1-2]。目前抗氧化作用的評價方法主要是體外化學法，包括清除DPPH(二苯代苦味酰基自由基)自由基法、ABTS自由基法、總自由基捕獲抗氧化參數法(TRAP)、總氧自由基清除能力檢測法(TOSC)、氧自由基吸收能力(ORAC)法、Fe3+還原(FRAP)法[3-4]。盡管化學方法因為簡單方便，已經被廣泛應用，但很多化學方法不是在生理pH值和溫度條件下進行的，也沒有考慮抗氧化劑在體內的吸收、代謝及其生理活性，不能準確反映抗氧化劑的體內抗氧化能力。生物系統比簡單的化學物系統復雜的多，并且抗氧化劑可能通過多種機制發揮效用。因此最好的測定方法是用動物模型和人體試驗，但是這些方法成本昂貴且費時，也不適合食品以及膳食組分中原始抗氧化劑的篩選。細胞培養模型為研究提供了一種經濟的、相對較快的方法，并且能夠闡明吸收、運輸和代謝中的一些機理問題[5]。因此有必要建立一種以細胞為基礎的測定抗氧化劑活性的方法，并藉此方法研究食品中或者植物化學物的一些潛在的具有抗氧化活性的物質。

近年來研究人員從許多天然化學產物中提取到的抗氧化劑多為多酚和黃酮類化合物。蜂膠是蜜蜂從植物芽胞或樹干采集的樹膠，混入蜜蜂的上額腺、蜂蠟而形成的芳香性樹脂狀固體物質，主要含黃酮類、萜烯類、酯類、醇類、酚類、有機酸、礦物質等[6]。因此，本實驗應用細胞模型，在Kelly等[3]的實驗基礎上，采用細胞抗氧化(CAA)法，以人肝癌Hep G2細胞、熒光探針為媒介，以熒光強度為指標，使用多功能酶標儀和熒光倒置顯微鏡分析蜂膠醇提物的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠醇提物 中國農業科學院蜜蜂研究所；人肝癌Hep G2細胞株 中國科學院細胞庫。

含青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養液、PBS Solarbio公司；0.25%胰酶-EDTA消化液、胎牛血清Gibco公司；培養皿、96孔板 Corning公司；細胞培養級二甲基亞砜(DMSO)、2′,7′-二氯熒光二乙酸鹽(DCFH-DA)、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2′-azobis (2-amidinopropane) Dihydrochloride，(ABAP) Sigma公司。

1.2 儀器與設備

AL204型精密天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HERA-cell150 CO2培養箱 美國Thermo公司；5417R型冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；SynergyTMHT型多功能酶標儀 美國Bio-Tek公司；IX71型熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

蜂膠醇提物溶液：稱取0.1g蜂膠溶于10mL DMSO中，配成質量濃度為10mg/mL的溶液，4℃保存備用，實驗前用無血清RPMI-1640培養液進行稀釋。

DCFH-DA熒光探針：稱取50mg DCFH-DA溶于10mL DMSO中，配成質量濃度為5mg/mL的溶液，－20℃保存備用，實驗前用無血清RPMI-1640培養液進行稀釋。

ABAP工作液：稱取0.1g ABAP溶于10mL PBS中，配成質量濃度為10mg/mL的溶液，－20℃保存備用，實驗前用無血清RPMI-1640培養液進行稀釋。

1.3.2 細胞培養

將人肝癌Hep G2細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下的CO2培養箱中傳代培養[7]。

1.3.3 細胞內熒光強度的測定[8]

取對數生長期的Hep G2細胞，接種于96孔板培養板(不使用外邊的孔，因為這些孔比內部孔變動大)，每個孔約含6 × 104個細胞，加入100μL RPMI-1640培養液。培養24h后除去培養液，PBS清洗一次。加入新鮮RPMI-1640培養液、蜂膠醇提物溶液、DCFH-DA熒光探針溶液，使得蜂膠醇提物的終質量濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/mL，每個質量濃度設5個復孔；DCFH-DA終濃度為25μmol/L，5%CO2、37℃培養箱中繼續培養1h。100μL PBS清洗細胞3次，加入ABAP 工作液使ABAP的終濃度為600μmol/L，用多功能酶標儀測其熒光值，測定條件：激發波長為485nm，發射波長為580nm，1h內每5min測定一次。對照組用DCFH-DA和ABAP處理，不加蜂膠醇提物；空白組用DCFH-DA處理，不加入ABAP和蜂膠醇提物。

1.3.4 細胞內抗氧化活性(CAA)的測定[3]

用Origin 8.0軟件計算時間-熒光強度曲線下的積分面積，并按照以公式(1)計算細胞內抗氧化活性值(CAA)。

式中：∫SA表示加入不同質量濃度蜂膠醇提物后的熒光值-時間曲線的積分面積；∫CA表示對照組熒光值-時間曲線的積分面積。

1.3.5 熒光倒置顯微鏡觀察測定蜂膠醇提物的細胞內活性氧清除率

取對數生長期的Hep G2細胞，配制成2×104個/mL的單細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔100μL，CO2培養箱孵育24h后棄去培養基，PBS洗一次。加入新鮮RPMI-1640培養液、蜂膠醇提物溶液、DCFH-DA熒光探針溶液，使得蜂膠醇提物的終質量濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/mL，DCFH-DA終濃度為25μmol/L，5%CO2、37℃培養箱中繼續培養1h。PBS清洗細胞 3次，加入800μmol/L ABAP，37℃避光反應30min，因為DCF熒光信號為綠色，故在藍色光激發下用熒光倒置顯微鏡觀察細胞并計數，每種質量濃度的蜂膠醇提物處理的細胞在明場和熒光模式下均選取3個視野計數，數據以x±s表示。按照公式(2)計算細胞內活性氧清除率(IC)。

式中：A為熒光模式下3個視野中陽性Hep G2細胞的平均數；B為明場下3個視野中Hep G2細胞的平均數。

1.3.6 數據處理

實驗數據以x±s表示，用Origin 8.0軟件計算曲線積分面積，應用SPSS13.0軟件進行方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蜂膠醇提物對細胞熒光強度的影響

圖1 不同質量濃度蜂膠醇提物對細胞熒光強度的影響Fig.1 Effect of adding different amounts of EEP on cellular fluorescence intensity

由圖1看出，細胞熒光強度隨蜂膠醇提物質量濃度的增加而下降，且加入蜂膠醇提物的細胞熒光強度與空白組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。實驗中的DCFH-DA本身沒有熒光，它可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成無熒光的DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使DCFH-DA熒光探針很容易地被裝載到細胞內。同時，進入細胞內的ABAP裂解成活性氧(ROS)，可以氧化DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光強度就可以反應細胞內活性氧的水平。熒光強度與細胞內活性氧水平呈正比，熒光強度越高，活性氧含量越高。蜂膠醇提物能顯著降低細胞內熒光強度，這說明蜂膠醇提物能夠降低細胞內活性氧的水平，具有明顯的抗氧化作用，抗氧化作用隨著蜂膠醇提物質量濃度的增大而增強，并呈良好的劑量-效應關系。本實驗中蜂膠醇提物質量濃度為0.5mg/mL時，抗氧化效果達到最高。

2.2 細胞內抗氧化活性(CAA)測定

圖2 蜂膠醇提物抑制ROS氧化DCFH的劑量-效應曲線Fig.2 Dose-response curve of inhibitory effect of EEP on ROS-induced DCFH oxidation

由圖2可知，蜂膠醇提物具有明顯的抗氧化活性，并且存在一定的劑量-效應關系，即抗氧化作用隨蜂膠醇提物質量濃度的增加而增強。CAA 值達到50(即CAA50)時，蜂膠醇提物的質量濃度為0.14mg/mL。Kelly等[3]曾做過藍莓的細胞抗氧化實驗，發現藍莓的CAA50對應的藍莓質量濃度為2～3mg/mL。由此表明，與藍莓相比，蜂膠的抗氧化能力更強。

2.3 熒光倒置顯微鏡觀察計數測定蜂膠醇提物的細胞內活性氧清除率

Liu等[5]采用的細胞模型主要是測定抗氧化劑的CAA值，由于細胞接種96孔板后，需要培養24h，每個孔中的細胞數會有所差異，熒光強度不穩定性，對實驗結果會有一定影響。因此在其基礎上用熒光倒置顯微鏡觀察細胞內熒光強度的變化，將有熒光和無熒光的細胞分別計數，可以更加直觀地、準確地看出蜂膠醇提物的抗氧化能力。

細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有綠色熒光的DCF。加入抗氧化劑，可以清除細胞內活性氧，使生成的DCF減少，即有綠色熒光的細胞數也減少。在熒光倒置顯微鏡的明場條件下測定細胞總數，在熒光觀察條件下測定被活性氧氧化而發出綠色熒光的細胞數，并計算二者的比值來判斷蜂膠醇提物的抗氧化活性。

圖3 熒光倒置顯微鏡下觀察蜂膠醇提物的抗氧化效果Fig.3 Antioxidant effect of EEP observed under converted fluorescence microscope

表1 蜂膠醇提物細胞內活性氧清除率Table 1 Cellular ROS clearance rates of EEP at different concentrations

圖3是各實驗組的細胞在明場和熒光模式下觀察到的有代表性的照片。空白樣品不經蜂膠處理，細胞幾乎都被染色。經不同質量濃度的蜂膠醇提物處理后，被染色的細胞有所減少，并且隨質量濃度的增加而減少(P＜0.05)。從表1可知，蜂膠醇提物有很強的清除細胞內活性氧的能力，隨著蜂膠醇提物質量濃度的增加，清除率從15.38%提高到47.05%。也就是說，當質量濃度達到0.5mg/mL時，生成的DCF減少，有熒光的細胞數減少，幾乎有一半的細胞內沒有熒光，細胞內活性氧的清除率接近50%。

本實驗室曾做過蜂膠醇提物的化學抗氧化實驗，已經證實了蜂膠醇提物具有明顯的抗氧化作用[9]。本次實驗是以活細胞為模型研究蜂膠醇提物的抗氧化作用，發現蜂膠具有明顯的抗氧化活性，這與以前的化學法抗氧化實驗結果相符。CAA法與化學法相比，能更有力的證明蜂膠的體內抗氧化作用。

蜂膠中起抗氧化作用的主要成分之一是黃酮類化合物，但并不是所有的黃酮化合物都有抗氧化活性，只有分子結構滿足一定條件時才能表現出較強的作用，其中最主要的是羥基化程度和羥基的位置，且一般認為B環中的鄰-二羥基起著主要作用[10]。為了進一步研究蜂膠的抗氧化活性，可以用蜂膠的水提物、乙醚提取物、超臨界提取物等繼續做細胞內抗氧化實驗；特別是色譜分離技術的發展，為分離分析蜂膠中單一的功能性化合物及進一步研究評價其生理活性功效帶來了新的技術支持；同時也可以嘗試其他能夠模擬生物體評估抗氧化能力的生物學方法。

目前公認的可以模擬生物體評估抗氧化能力的3種方法：ORAC法、CAP-e方法[11]、CAA法都使用了熒光探針。借助探針，研究人員能夠在很短時間內獲得所需活性氧的相關信息，其理論依據是借助活性氧的某些特性，使得原來不產生熒光的探針轉變成具有熒光特性的化合物，或使檢測探針原本具有熒光變弱甚至是猝滅，通過對熒光強度改變的測定間接實現對待測活性氧的量化分析。熒光探針是一個非常有發展前景的揭示分子生物功能的工具，它能夠提供有機細胞系統內目標分子短暫的空間信息，這為深入了解活性氧的特性提供了一條新的途徑。

本實驗雖然可以證明蜂膠具有抗氧化活性，但存在不足之處：一是蜂膠醇提物具有誘導癌細胞凋亡的作用，本實驗室也做了蜂膠醇提物誘導人肝癌Hep G2細胞凋亡的實驗，用蜂膠處理Hep G2細胞，會殺死細胞，可能影響實驗結果；二是細胞接種于96孔板后，需要培養24h，每個孔中的細胞數會有所差異，對實驗結果也會有一定影響；三是用熒光倒置顯微鏡觀察，不同視野細胞數會有所不同，被染色的細胞數也會不同，不能十分準確的計算實驗結果。

3 結 論

采用細胞模型研究不同質量濃度的蜂膠醇提物處理Hep G2細胞前后熒光強度以及陽性細胞數目的變化，結果表明蜂膠醇提物具有很好的抗氧化作用，隨著蜂膠醇提物質量濃度的增大而增強，并呈良好的劑量-效應關系。CAA值達到50時，蜂膠醇提物質量濃度僅0.14mg/mL，是藍莓CAA50的十分之一。當蜂膠醇提物質量濃度達到0.5mg/mL，細胞內活性氧的清除率高達47.05%。因此可以認為，蜂膠醇提物具有非常好的細胞內抗氧化能力，可以作為天然的抗氧化劑開發出保健食品。

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Application of Cell Culture Model to Antioxidant Activity Analysis of an Ethanol Extract from Propolis

WU Zheng-shuang1,2，DONG Jie2，ZHANG Hong-cheng2，ZHAO Liang-liang3，GAO Wen-hong1,*
(1. College of Light Industry and Food, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China；2. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；3. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China)

A cellular antioxidant activity (CAA) assay for quantifying the antioxidant activity of an ethanol extract from propolis (EEP) provided by Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences has been developed. Dichlorofluoresceindiacetate (DCFH-DA) as a probe, which is easily oxidized into fluorescent dichlorofluorescein (DCF) by reactive oxygen species (ROS), was trapped within cells and the method was used to measure the ability of EEP to prevent the formation of DCF by 2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (ABAP)-generated peroxyl radicals in human liver carcinoma HepG2 cells with multi-functional microplate reader and inverted fluorescence microscope. The decrease in cellular fluorescence intensity compared to the control cells indicates the antioxidant capacity of EEP. In addition, this bioactivity depended on dose. The concentration of EEP corresponding to CAA unit50 was only 0.14 mg/mL. A ROS clearance rate of 47.05% was obtained at an EEP concentration of 0.5 mg/mL.

human liver carcinoma HepG2 cells；reactive oxygen species；cellular antioxidant activity

S896

A

1002-6630(2010)19-0190-04

2010-05-31

國家現代農業(蜂)產業技術體系建設專項(NYCYTX-43)；農業部公益性行業(農業)科研專項(nyhyzx07-041)

吳正雙(1985—)，男，碩士研究生，主要從事食品質量與安全研究。E-mail：zhshwu1208@163.com

*通信作者：高文宏(1970—)，女，副教授，博士，主要從事食品質量與安全研究。E-mail：zzhc@sohu.com