液態發酵法制備菜籽ACE抑制肽菌種的篩選

鞠興榮，金 晶，袁 建，王立峰,2，何 榮,2

液態發酵法制備菜籽ACE抑制肽菌種的篩選

鞠興榮1，金 晶1，袁 建1，王立峰1,2，何 榮1,2

(1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

采用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、白地霉、產朊假絲酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉對菜籽粕進行液態發酵，以氮溶解指數、SN-TCA、氨基酸態氮、肽得率和ACE抑制活性為評價指標，對液態發酵生產菜籽ACE抑制肽的菌種進行篩選。結果表明：在上述菌種中枯草芽孢桿菌液態發酵所得肽得率最高，并且具有最高的ACE抑制活性，菌種優勢明顯，是液態發酵菜籽粕生產ACE抑制肽的優勢菌種。

菜籽肽；液態發酵；菌種篩選；ACE抑制肽

菜籽餅粕是菜籽榨油之后的副產品，其蛋白含量為35%～42%[1]。菜籽蛋白經水解產生的小肽具有多種生物活性，其中ACE抑制肽由于安全性高、副作用少、易吸收，已經成為活性肽研究的熱點[2-3]。發酵法制備大豆[4-6]和牛奶[7-8]的ACE抑制肽的研究在我國已有報道，而使用液態發酵制備菜籽ACE抑制肽的研究目前在國內還屬于空白，因此具有很高的研究價值。

菌種的選擇對菜籽ACE抑制肽的制備非常關鍵，這主要是因為液態發酵條件下不同的菌種所產的蛋白酶不同，其對菜籽蛋白的作用位點也不相同，導致其水解產物的生物活性差別很大[9]。本實驗以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、白地霉、產朊假絲酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉對菜籽粕進行液態發酵，以ACE抑制活性為主要評價指標，并考察氮溶解指數、SN-TCA、氨基酸態氮、肽得率，對液態發酵制備ACE抑制肽的菌種進行比較研究，篩選出液態發酵法制備ACE抑制肽的優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與菌種

菜籽粕，以Canola菜籽為原料，通過索氏抽提脫油制得，粗蛋白含量43.26%；血管緊張素轉化酶(ACE，酶活力0.25U)、HHL、Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司。

三氯乙酸(TCA)、甲醛等其他試劑均為分析純。

Bacillus.subtilis 10160、Candida utilis 1769、Aspergillus niger 2377、Bacillus licheniformis 20006、Geotrichum candidum 31418、Candida utilis 40294、Actinomucor elegans 40252 中國工業微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；PHS-3C型精密數顯pH計、722N紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器廠；GL-20B型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；全溫立式振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 斜面培養

將保藏菌種接入基礎培養基(按各菌種說明書配制)，在一定溫度(霉菌28℃，細菌30℃)、一定時間(細菌24h，霉菌5d)下進行培養，使其轉接活化。

1.3.2 菌種活化

挑取兩環種子培養基活化后菌株，接入錐形瓶，8層紗布封口，在恒溫振蕩培養箱中進行擴大培養，控制溫度30℃，轉速180r/min，細菌培養24h，霉菌培養3d。使其菌體濃度達到108個/mL。

1.3.3 發酵培養

從已制備好的種子培養基中取出一定體積的菌懸液接入已滅菌液態發酵培養基中，液態發酵培養基的料液比1:20(m/V)，接種量為1:20(V/V)，8層紗布封口，控制在30℃，180r/min的恒溫振蕩培養箱內進行培養，培養一定時間后取樣進行測定。

1.3.4 發酵液處理

將培養一定時間的發酵產物取出，2～4℃、4000×g離心15min，測定其上清液體積，用0.45μm微孔濾膜過濾上清液，除去不溶物和細菌，備用。

1.3.5 氮溶解指數測定

參照文獻[10]所述方法進行測定。氮溶解指數按式(1)計算。

1.3.6 SN-TCA指數測定

參照文獻[11]所述方法，取5mL處理液，加入等體積質量濃度為10g/100mL的三氯乙酸(TCA)，靜置30min，2～4℃、5000×g離心20min，取5mL上清液進行微量凱式定氮，測定其氮含量。SN-TCA指數按式(2)計算。

1.3.7 氨基酸態氮得率測定

采用甲醛滴定法[12]測定提取液中－NH2含量，氨基酸態氮按式(3)計算。

1.3.8 肽得率測定

參照文獻[13]所述方法，取2.5mL處理液，加入等體積10g/100mL的三氯乙酸(TCA)，靜置30min，2～4℃、5000×g離心20min，取2mL上清液，加8mL雙縮脲試劑，25℃靜置30min，測OD540nm值。肽得率按式(4)計算。

1.3.9 ACE抑制活性測定

參照Cushman等[14]的方法，作出適當的修改，具體步驟如下：用含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(pH8.3)將HHL配制成5.0mmol/L的溶液。取100μL的HHL和40μL的水解產物混合，于37℃保溫3min后，加入10μL ACE(溶于蒸餾水，活力為0.1U/mL)，混勻后37℃保溫30min，再加入250μL的1mol/L HCl溶液終止反應，再加入1.7mL醋酸乙酯，15s振蕩混勻，5000×g離心10min，用移液管吸取1mol/L醋酸乙酯層，真空冷凍干燥2h后，加入3mL蒸餾水，在228nm波長處測定其吸光度。ACE抑制活性按式(5)計算。

式中：A為ACE及ACE抑制肽均參與時所測的吸光度；B為ACE抑制肽不參與時所測的吸光度；C為ACE不參與時所測的吸光度。

2 結果與分析

在預試驗基礎上，在24～48h內，液態發酵菜籽蛋白的效果較好，所得各項指標均達到最優值，因此，選用在24、36、48h的實驗數據來進行分析。

2.1 不同菌種液態發酵對菜籽蛋白氮溶解指數的影響

氮溶解指數反映發酵水解液中可溶性氮的含量，從一定程度上也可以反映發酵效果的好壞。由圖1可知，隨著發酵時間的增加，各個菌種的氮溶解指數都有所增加，這是由于隨著發酵的進行，菌種代謝所產生的蛋白酶將菜籽蛋白逐步水解，產生了易溶于水的小分子短肽和氨基酸。通過比較可以得出：黑曲霉、白地霉、產朊假絲酵母的氮溶解指數在經過一定時間的液態發酵后，與原樣相比并沒有顯著提高，原因可能是液態發酵的環境不適合這幾種菌種的產酶或菜籽粕中存在不適合這幾種菌產蛋白酶的因子；宇佐美曲霉和雅致放射毛霉的氮溶解指數居中，在50%左右；枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的發酵效果最好，其氮溶解指數均超過50%，其中枯草芽孢桿菌在發酵48h的條件下氮溶解指數高達69.4%，說明發酵過程中產生了較多的蛋白酶，使蛋白質大量水解。

圖1 不同菌種液態發酵對氮溶解指數的影響Fig.1 Comparison of NSI using different fermentation strains

2.2 不同菌種發酵菜籽蛋白對菜籽蛋白SN-TCA指數的影響

SN-TCA指數是在特定條件下，經過三氯乙酸沉淀后水解產物中可溶性氮的質量分數。三氯乙酸作為一種蛋白質沉淀劑，可以沉淀蛋白質和大分子的肽段，隨著反應的進行，蛋白質肽鏈被切成大小不等的肽段，SN-TCA指數會隨之提高，SN-TCA指數可以定性地反應蛋白質的分解情況，溶解指數越高，表明較短肽段的含量越高。

圖2 不同菌種液態發酵對SN-TCA指數的影響Fig.2 Comparison of SN-TCA index using different fermentation strains

由圖2可知，SN-TCA指數與氮溶指數變化趨勢基本相似，黑曲霉、白地霉、產朊假絲酵母的SN-TCA指數同樣提高不明顯，而其他幾種菌種中，也僅有雅致放射毛霉的SN-TCA指數與氮溶解指數變化趨勢相比稍有提高，這可能是由于雅致放射毛霉發酵過程中，形成的可溶性蛋白較少，多為小分子短肽和氨基酸，SN-TCA指數表明枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、雅致放射毛霉在液態發酵條件下，短肽和氨基酸的含量較高。

2.3 不同菌種發酵對菜籽蛋白氨基酸態氮得率的影響

圖3 不同菌種液態發酵對氨基酸態氮得率的影響Fig.3 Comparison of amino nitrogen yield using different fermentation strains

由圖3可知，氨基酸態氮得率與氮溶解指數和SNTCA指數變化趨勢基本相似，也是隨著發酵時間的延長而逐步增加，這說明各個菌種所產生的蛋白酶在水解蛋白的同時也產生了大量的端肽酶，將短肽水解成氨基酸。盡管黑曲霉的氮溶解指數不高，但是其氨基酸態氮得率卻很高，在48h達到了2.71%，這說明黑曲霉在液態發酵的條件下，產生的大多是端肽酶，因此，在水解過程中產生較多的氨基酸。

2.4 不同菌種發酵對菜籽蛋白肽得率的影響

圖4 不同菌種液態發酵對肽得率指數的影響Fig.4 Comparison of peptide yield using different fermentation strains

肽得率是發酵處理液中短肽含量與原料總量的比值，它反映了發酵產品中低分子短肽含量的高低，由圖4可知，24h是各個菌種肽得率最高的發酵時間，隨著發酵時間的延長，各個菌種的肽得率均有所降低，這可能是由于到了發酵的后期，隨著發酵時間的延長，各個菌種開始產生大量的外肽酶，將此前所產生的菜籽多肽進一步水解成游離氨基酸，導致多肽含量的降低，由于外肽酶產生的量不同，因此肽得率減少的幅度也有所不同。通過比較可以發現，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌進行發酵所得肽得率最高，可以達到22%左右，宇佐美曲霉次之，而其他菌種發酵的肽得率均不高。因此，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌比較適合進行液態發酵來生產低分子小肽。

2.5 不同菌種發酵對菜籽蛋白ACE抑制活性的比較

圖5 不同菌種液態發酵對ACE抑制活性的影響Fig.5 Comparison of ACE inhibition activity using different fermentation strains

ACE抑制肽也是一種ACE抑制劑，它通過對ACE的抑制而起到降血壓作用。ACE抑制活性對于篩選生產ACE抑制肽的菌種來說是一個很重要的指標。由圖5可知，大部分菌種的ACE抑制活性在24h達到最大值，隨后逐步降低，這是由于對ACE起抑制作用的是一些特定序列的短肽，而隨著發酵的進行，短肽被進一步水解，使其不再具有ACE抑制活性。與其他菌株相比，枯草芽孢桿菌的ACE抑制活性明顯較高，在發酵24h時可以達到70.5%，次之是地衣芽孢桿菌和雅致放射毛霉，發酵得到的小肽的ACE抑制活性也均超過50%以上，相比其肽得率，宇佐美曲霉盡管肽得率也不低，但發酵所得的小肽ACE抑制活性不高，這可能是由于其所產的蛋白酶作用位點不同，沒有得到具有ACE抑制作用的小肽。

3 結 論

本實驗通過使用枯草芽孢桿菌等7種菌種進行液態發酵，以ACE抑制活性為主要指標，肽得率等為輔助指標，旨在篩選出適合液態發酵環境，發酵產物中含有較高ACE抑制活性的小肽的菌種。

實驗表明，枯草芽孢桿菌對菜籽粕進行液態發酵，可以得到ACE抑制活性較高的小分子短肽，其最高ACE抑制活性超過70%，同時，通過液態發酵得到的肽得率可以達到25%左右，肽得率較高。枯草芽孢桿菌在液態發酵條件下，各個指標的優勢都很明顯，因此，可以作為液態發酵生產高ACE抑制活性短肽的最佳菌種，用于今后的研究。實驗還表明，黑曲霉在液態發酵條件下產生了大量的端肽酶，因此，若與其他菌株進行聯用，可以起到脫苦等作用，適合用于混菌發酵。

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Screening of an Optimal Strain for Producing Rapeseed-originated Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides by Liquid-state Fermentation

JU Xing-rong1，JIN Jing1，YUAN Jian1，WANG Li-feng1,2，HE Rong1,2
(1. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to search for an optimal stain for the production of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from rapeseed meal by liquid-state fermentation, seven common microorganisms including Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Aspergillus niger, Geotrichum candidum, Candida utilis, Actinomucor elegans and Aspergillus oryzae as a starter for rapeseed meal fermentation were compared for their differences in five fermentation parameters, namely peptide yield, nitrogen solubility index (NSI), amino nitrogen yield, soluble nitrogen in aqueous trichloroacetic acid (SN-TCA) content and ACE inhibition activity. Among the above microorganisms, Bacillus subtilis was found to give both the highest peptide yield and ACE inhibition activity and grow dominantly, thereby being a superior strain for the production of ACE inhibitory peptides from rapeseed meal by liquid-state fermentation.

rapeseed-derived peptide；liquid-state fermentation；strain screening；ACE inhibitory peptide

Q93.331

A

1002-6630(2010)19-0212-04

2010-01-10

國家農業成果轉化資金項目(2009C10045)；國家“863”計劃項目(2007AA10Z331)；江蘇省教育廳自然科學研究項目(08KJB55004)

鞠興榮(1957—)，男，教授，博士，主要從事食品營養及功能性成分研究與開發。E-mail：xingrongju@163.com