卵巢癌組織中IL-6和IL-8及TNF-α mRNA的表達及其意義

劉淑英 儲 平 楊 鐸 張玉平

濟寧市第一人民醫院（272111）

卵巢癌是婦產科常見腫瘤之一，由于起病隱匿，難以早期發現、早期治療，因而成為婦產科病死率最高的惡性腫瘤[1,2]，嚴重威脅著患者的生命。有研究證實，卵巢癌患者血清、腹水中IL-6、IL-8、TNF-α等細胞因子的表達異常升高[3]，但卵巢癌組織中上述因子的表達情況及其在癌癥發生、發展過程中的作用機制尚不明確。為此，我們采用熒光定量PCR的方法檢測了正常卵巢組織及卵巢癌組織中IL-6、IL-8、TNF-α等mRNA的表達水平，以期通過分析細胞因子轉錄水平的改變，探討卵巢癌的內在發病機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇山東省濟寧市第一人民醫院2004年5月至2008年11月收治的原發卵巢癌患者68例為實驗組，年齡32～72歲，平均62歲，術前均未接受放化療治療。正常對照組卵巢組織取自同期60例子宮肌瘤行全子宮加一側或雙附件切除患者，年齡39～59歲，平均年齡55歲。兩組患者年齡差異無統計學意義（P＞0.05），所有診斷均經病理檢查證實。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本收集

術中切取標本，用無菌生理鹽水沖凈血液后迅速置于液氮中冷凍，然后轉入- 80℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計與合成

根據GeneBank數據庫提供的IL-6、IL-8、TNF-α基因以及內參β-Actin（ACTB）基因序列，設計跨外顯子引物，并采用Blast在線對所設計的引物進行特異性的比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），引物序列見表1。所有引物均由上海博尚公司合成。

1.2.3 組織總RNA的提取及cDNA的合成

將凍存的組織在液氮中研磨，加入Trizol（Invitrogen公司）充分裂解細胞，按照說明書提取總RNA，經過酚和氯仿抽提后溶解到DEPC處理的水中。瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外線分光光度計測定吸光度值以確定RNA 濃度和純度。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

1.2.4 cDNA合成

反應體系（20μL）含RNA 2μg、Oligo （dT）1μL、M-MLV逆轉錄酶 （200U/μL） 1μL、dN TP （10mmol/L）1μL、5×緩沖液4μL及DEPC處理三蒸水。反應條件為42 ℃延伸60min合成cDNA，95℃ 5min 滅活M-MLV逆轉錄酶，4℃冷卻5min，置于- 20℃備用。

1.2.5 實時熒光定量PCR

應用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行半定量檢測，反應體系（25μL）含：第一鏈cDNA 1μL，2×SYBR Green Mix （Takara公

1.3 統計學處理

采用SPSS11.0和Excel統計軟件對實驗數據統計分析。相對表達率以±s表示，經正態性檢驗和方差齊性檢驗后，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為有統計學差異，P＜0.01為統計學差異顯著。

2 結 果

2.1 PCR擴增特異性

圖1 各基因擴增產物的溶解曲線

IL-6、IL-8、TNF-α以及內參基因ACTB擴增產物的溶解曲線均呈現單一峰（圖1）；瓊脂糖電泳結果均顯示為單一條帶，其片段大小與預先設計的產物大小一致，沒有非特異性擴增和引物二聚體的存在。上述結果說明實時熒光定量PCR擴增反應體系具有很好的特異性。司）12.5μL，5μmol/L上下游引物各1μL，三蒸水9.5μL。反應條件為95℃ 5s、95℃ 15s、60℃ 15s、72℃ 35s（收集熒光），40個循環。經溶解曲線和2%瓊脂糖電泳，判斷擴增產物特異性。溶解曲線反應條件：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，6o℃ 15s，速度為1.6℃/s。

1.2.6 計算相對表達率

內參基因表達穩定，受實驗因素影響小，因而可通過目的基因相對于內參基因ACTB的表達比來表示不同目的基因的表達變化。相對定量分析（2△△CT）公式為：Ratio=2△CT目的（對照一樣本）／2△CT內參（對照一樣本）。

2.2 IL-6、IL-8、TNF-α在正常和卵巢癌組織中的表達

IL-6、IL-8、TNF-α在所有檢測標本中均存在表達，其相對于內參基因ACTB的相對表達比見圖2。

分析結果顯示，卵巢癌組織中IL-6和IL-8的表達明顯高于正常對照組織，分別達到正常組織表達量的（8.78±1.32）和（11.41±1.65）倍，統計學差異非常顯著（P＜0.01）；與其相比，腫瘤組織中TNF-α的表達差異較小，為正常對照組織的（2.19±1.02）倍，但仍具有明顯的統計學差異（P＜0.05），見表2。

表2 IL-6、IL-8、TNF-α在正常和卵巢癌組織中的表達

圖2 IL-6、IL-8、TNF-α在正常和卵巢癌組織中的表達

3 討 論

卵巢癌是婦科病死率最高的惡性腫瘤，其發病機制的研究受到了越來越多的重視[4]。近年來，有關于卵巢癌細胞因子的研究取得了可喜的進展，研究發現卵巢癌患者外周血多種細胞因子的表達水平出現明顯的異常[5,6]，這說明細胞因子的表達與卵巢癌的發生、發展存在著密切的關系。但值得注意的是，外周血細胞因子的表達水平受到機體和外來多種因素的影響，因而不能直接反映腫瘤局部的變化情況。那么卵巢癌腫瘤組織中細胞因子的表達是否也存在著相應的變化呢？這種改變是否發生于細胞因子的轉錄水平呢？為了解決上述問題，我們采用實時熒光定量PCR的方法檢測了卵巢癌組織中IL-6、IL-8、TNF-α等細胞因子mRNA的表達，并與正常卵巢組織對比，分析了上述細胞因子的表達變化與卵巢癌發病之間的關系。

目前實時熒光定量PCR技術不但實現了從定性到定量的飛躍，而且具有高度的敏感性、準確性以及較好的可重復性，目前已逐漸成為檢測低豐度mRNA表達的最敏感準確的方法。

IL-6主要來自于單核-巨噬細胞、淋巴細胞以及成纖維細胞的合成分泌，在機體免疫應答過程中發揮著重要的作用[7]。近年來發現腫瘤細胞也可分泌IL-6。我們的檢測結果發現，卵巢癌組織中IL-6 mRNA表達明顯高于正常組織，兩組比較有顯著性差異，這說明卵巢癌發病過程中，腫瘤細胞和浸潤淋巴細胞合成IL-6水平明顯增加。Nilsson等[8]發現體外培養的卵巢癌細胞培養上清中IL-6的活性明顯增強，并可進一步刺激腫瘤細胞的增殖、減少癌細胞之間的黏附作用、促進新生血管的生成，進而促進腫瘤的轉移和浸潤，因此腫瘤細胞分泌IL-6對于腫瘤的發生、發展起到了重要的作用。另一方面，腫瘤局部高表達的IL-6，作為一種免疫抑制因子，可通過旁分泌作用抑制浸潤淋巴細胞、單核細胞的腫瘤細胞的增殖和殺傷作用，從而達到使腫瘤細胞逃避免疫監視、免疫殺傷的作用。

IL-8是一種多功能趨化因子和促血管生長因子，可促進腫瘤的生長、新生血管的生成，并通過影響細胞的黏附促進腫瘤細胞的轉移[9]。我們的檢測結果顯示，與IL-6相類似，卵巢癌組織中IL-8的表達水平也明顯高于正常卵巢組織。

TNF-α是單核-巨噬細胞產生的一種多功能細胞因子，參與多項免疫應答的調節。我們的實驗結果證實卵巢癌組織中TNF-α的轉錄水平高于正常卵巢組織。有研究認為，腫瘤細胞合成的TNF-α可通過自分泌和旁分泌作用刺激腫瘤細胞自身的增殖，但也有學者的觀點恰好相反，認為TNF-α可誘導腫瘤出血、壞死，從而達到抑制腫瘤生長的作用，甚至有望成為治療腫瘤的生物制劑[10]。

卵巢癌細胞合成、分泌的細胞因子通過自分泌、旁分泌等作用可誘導腫瘤組織中浸潤的單核細胞、淋巴細胞等釋放的細胞因子發生改變，形成級聯放大作用，甚至影響到外周血、腹水中細胞因子的水平，從而達到臨床檢測的目的。

需要注意的是，機體的細胞因子形成一個復雜的網絡系統，相互協調、相互制約，任何一種細胞因子的改變都不可能是孤立的，而且在不同的生理和病理條件下往往發揮不同的免疫學作用。因此，腫瘤環境下細胞因子的變化需要綜合分析，才能有助于探討腫瘤的發生、發展。

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