人腸道病毒71型亞單位疫苗的研制

郝 翊，秦 川

(北京協和醫學院 中國醫學科學院實驗動物研究所 衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

人腸道病毒71型亞單位疫苗的研制

郝 翊，秦 川

(北京協和醫學院 中國醫學科學院實驗動物研究所 衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

目的 利用原核表達技術制備人腸道病毒71型(EV71)的亞單位融合疫苗，并通過小鼠模型對其保護效果進行評價。方法 在大腸桿菌中融合表達EV71的亞單位肽段，隨后將肽段免疫雌鼠，對其交配后產下的幼鼠進行病毒感染，通過檢測其組織內的病毒拷貝數和病理變化，對疫苗的保護效果進行評價。結果 通過肽段融合的方法，得到五種備選疫苗，分別為VacA，VacB，VacC，VacD和VacE，這五種疫苗均具有一定的體外保護能力，并且VacB和VacC與正常人大腦組織無明顯交叉反應。動物模型評價結果顯示，VacB和VacE能賦予幼鼠抗病毒感染的保護效果。結論 利用EV71的小鼠感染模型評價了針對EV71的亞單位聯合疫苗，VacB和VacE的保護效果較好，此外，VacB與人腦組織間無明顯交叉反應，可以作為潛在的無神經毒性的臨床使用疫苗。

人腸道病毒71型;融合亞單位疫苗;小鼠

人類腸道病毒 71型(human enterovirus 71，EV71)是手足口病的病原體之一，具有嗜皮膚性和嗜神經性，較之脊髓灰質炎病毒具有更廣泛的神經毒性。該病毒主要感染5歲以下兒童，導致手足口病及皰疹性咽峽炎，少數情況下引起的并發癥包括腦膜炎、無力性麻痹、肺水腫、肺出血等，嚴重病例可導致死亡［1，2］。EV71 基因組全長 7413 bp，編碼2193個氨基酸。主要有 P1，P2和 P3三種蛋白，P1蛋白可被蛋白酶切割為VP1，VP2，VP3和VP4，為組成病毒粒子的結構蛋白，而P2與P3則被切割為有活性的功能蛋白，負責病毒RNA的復制與蛋白組裝［3］。VP1蛋白被認為是主要的抗原決定位點集中區域，曾被多次報道用來研制病毒疫苗［4］。1975年在保加利亞發生超過750例以嬰幼兒發病為主的EV71感染，無手足口病癥狀，只出現中樞神經系統癥狀的群體發病，其中報告無菌型腦膜炎545例、類脊灰樣麻痹52例、腦干腦炎68例(死亡44例)［5］。與EV71感染有關的神經系統表現因小腦、腦干和間腦等受累部位不同而各具特點。神經源性肺水腫病死率高，是EV71感染的重要并發癥和主要死因，多由手足口病和皰疹性咽峽炎進展而來，并呈現中樞神經受累癥狀，如肢無力、肢感覺遲鈍和癲癇發作等，同時伴有輕微的交感神經緊張癥狀，如失眠、多汗和麻痹性腸梗阻等［6］。

我國1981年首次在上海發現本病，隨后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、廣東等十幾個省(市)均有報道［6］。從2009年年初到 4月 7號，網絡直報顯示，全國累計報告手足口病例115618例，其中重癥773例，死亡50例。從1999年至2008年，分離自深圳、上海、重慶、山東臨沂和阜陽市的EV71病毒均為 C4亞型，對其基因組序列分析表明，各分離株具有很高同源性，表明腸道病毒 EV71沒有發生明顯變異。

目前EV71感染尚無有效的治療藥物。因此，盡快研制出安全有效的病毒疫苗，無疑是防止EV71傳播的有效手段之一。

本文采用融合的亞單位疫苗策略，分別選擇EV71多肽鏈中三個肽段區域進行融合的實驗和研究，構建出5種融合亞單位備選疫苗;并利用 EV71小鼠模型，對該疫苗的保護效果分別作出評價。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株、動物

EV71毒株 Fuyang-0805，由中國疾病控制中心贈送，培養于人橫紋肌瘤細胞(RD)上，培養基為含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM［5］。SPF級 ICR小鼠，6周齡，雌性。購于維通利華公司(合格號:0030794)。

1.2 主要試劑

Qiagen試劑盒，ReverTra-Plus試劑盒均購自Invitrogen公司;Ni-HTA購自Novagen公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG，DAB染色試劑盒均購自中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒分離純化:將已經病變的RD細胞凍融3次，離心5000 g×20 min，除去細胞碎片，上清離心80000 g×3 h，病毒沉淀懸浮在DMEM培養基中。EV71滅活條件為56℃，30 min。

1.3.2 融合亞單位蛋白表達與純化:融合表達的亞單位蛋白共分為5種，每種蛋白分別包含3個肽段，每兩個肽段之間用相應的蛋白 Linker連接。其中第一個與第二個肽段間用 Linker1連接，序列為:EASPPGE，第二個與第三個肽段間用Linker2連接，序列為:G4S。詳見引物序列(表1)。PCR擴增、酶切、連接等分子生物學操作，均按照分子克隆進行。先將目的基因克隆到 pET28a(+)載體中，轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，蛋白表達在E.coli BL21(DE3)中進行。攜帶表達質粒的菌株在含有50 μg/mL卡那霉素的 LB培養基中培養，當 A600達到0.6時，加入終濃度為0.2mmol/L的 IPTG，繼續在室溫(25℃)下培養8 h。收獲的菌體用超聲波破碎后，提取其中的包涵體，洗滌完全的包涵體用8 mol/L尿素溶解，再用Ni-HTA進行親和層析純化，純化后的蛋白透析到0.9%的生理鹽水中，蛋白濃度測定使用 Bradford方法［6］，其純度用 SDS-PAGE 來檢測。

1.3.3 純化蛋白免疫小鼠:作為備選疫苗的各重組蛋白首次免疫時，與等體積弗氏完全佐劑混合，劑量為50 μg/只，免疫方式為腹腔注射;初次免疫 3周后進行第二次免疫，各重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合，劑量與第一次相同。一周后，雌鼠進行交配。EV71的免疫劑量為 107TCID50/只。陰性對照組抗原獲得方式為:將未轉入表達載體的大腸桿菌裂解上清。

1.3.4 間接ELISA方法檢測免疫小鼠血清抗體效價:在96孔板中，將各重組蛋白進行包被，每孔蛋白劑量為1 μg，4℃。過夜后，用含 3%BSA的 PBST封閉;隨后加入梯度稀釋的抗血清，37℃靜置1 h。PBST洗滌3次，加入10000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠的二抗，37℃靜置1 h。PBST洗3次后，加入 TMB底物顯色，使用2 mol/L的H2SO4終止反應，在450 nm與630 nm處，雙波長讀取數據，以大于陰性血清數值2.1倍的最低稀釋度作為抗血清的效價。

表1 構建融合蛋白表達基因的引物序列Tab.1 Primers used for constructing fusion genes for antigens expression

1.3.5 病毒中和試驗測定免疫血清中和指數:病毒中和試驗使用RD細胞作為受體細胞，將RD細胞以2×104/孔的濃度接種入96孔板，37℃中培養過夜。抗血清經過56℃處理30 min，以滅活補體成分。抗血清和病毒的稀釋，使用含 2%FBS的DMEM培養基，抗血清以2倍的梯度稀釋，分別與等體積的200TCID50的EV71混合，37℃中溫育1 h;隨后將混合液加入細胞孔內，3 d后觀察細胞病變，根據Reed等［7］描述的方法計算中和指數。

1.3.6 免疫組化:正常人腦組織石蠟切片脫蠟。3%雙氧水室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。用枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復后，用 10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，滴加一抗工作液(將各重組蛋白分別免疫小鼠后得到的抗血清)，4℃過夜。PBS沖洗3次。滴加二抗工作液(辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG)，37℃孵育30 min后，PBS沖洗3次。DAB顯色，自來水沖洗，復染，封片，晾干，用光學顯微鏡觀察顯色結果［8］。

1.3.7 動物感染:動物感染實驗對象為1日齡的ICR幼鼠。攻毒前禁食8 h，每只幼鼠攻毒劑量為:5×107TCID50，病毒懸液體積為 50 μL，感染方式為腹腔注射，分別在攻毒后 1 d，3 d，5 d，7 d解剖幼鼠，收集小腸及骨骼肌樣品，用于半定量PCR和病理分析。

1.3.8 半定量PCR:稱取30 mg的肌肉組織用于RNA提取。提取使用 Qiagen試劑盒，反轉錄使用ReverTra-Plus試劑盒進行，cDNA擴增使用隨機引物，半定量 PCR使用 EV71特異性引物 HEV71-S:5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’ 和 HEV71-A 5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’，其擴增區域對應于基因組中的堿基位置為:2372–2598［9，10］。使用GAPDH基因做定量內參。

1.3.9 病理觀察:免疫及攻毒的小鼠安樂處死后，用10%的福爾馬林固定組織樣本，修塊后石蠟包埋，使用蘇木素伊紅染色，隨后光學顯微鏡下觀察病理變化。

2 結果

2.1 抗原表達與純化

5種融合亞單位抗原分別包含3個肽段區域，其編碼區大小，3個肽段編碼區之間分別以蛋白Linker編碼序列連接，并與6×His tag融合(圖1)。

目的基因在大腸桿菌中表達，蛋白均以不可溶的包涵體形式表達，表達的蛋白經過鎳柱親和層析純化后，純化蛋白經 SDS-PAGE檢測，其純度達到95%以上(圖2)

圖1 融合抗原表達構建示意圖Fig.1 Diagram for fusion antigens expression

圖2 SDS-PAGE檢測純化的融合抗原Fig.2 SDS-PAGE detect the purified fusion antigens

2.2 抗原與人腦組織的免疫交叉反應

病毒的抗血清與正常人腦組織間存在明顯的交叉反應，重組蛋白VacA，VacD和VacE與正常人腦間的交叉反應與全病毒相似，而VacB和VacC與正常人腦間不存在交叉反應，該結果表明，VacB和VacC兩種抗原無潛在的引發神經毒性的能力(圖3，見彩插 2)。

2.3 病毒中和指數

用5種重組蛋白分別免疫小鼠。初次免疫后，將4周、5周與7周采集血樣所得到的抗血清，分別進行病毒中和實驗，進而檢測其面臨病毒攻擊時對于RD細胞的保護能力。檢測結果用中和指數表示(圖4)。經過兩次免疫后，滅活病毒免疫的抗血清的中和指數可達29以上，雖然其它重組蛋白的抗血清的中和指數較低，VacB與VacE抗血清的保護能力明顯高于其它三種，其中和指數均達到27。表明這兩種重組蛋白具有較好的保護效果，并且其抗血清的中和指數在第二次免疫后四周時(幼鼠出生時)仍高于26，推測透過胎盤屏障的母源抗體可以賦予幼鼠良好的抗病毒保護能力。

2.4 動物保護效果

為進一步驗證各重組蛋白對于小鼠的保護能力，在雌性小鼠第二次免疫后一周交配;隨后對1日齡幼鼠進行攻毒試驗，在5 d后解剖幼鼠取材，通過半定量PCR鑒定骨骼肌的病毒拷貝數，觀察骨骼肌與小腸的病理表現。綜合這兩項指標來驗證在面臨病毒感染時，抗原對于幼鼠的保護效果。

半定量PCR結果見圖5，陰性對照組幼鼠(大腸桿菌裂解上清免疫雌鼠)的組織內可以檢測到明顯的病毒RNA;與陰性對照組相比，各重組蛋白免疫的幼鼠骨骼肌中病毒含量均明顯下降，其中VacB與VacE組的病毒RNA檢測不到，效果與滅活全病毒免疫效果相同［11］。

圖4 各重組蛋白抗血清的中和指數Fig.4 Neutralization titer of the anti-sera of antigens

圖5 半定量PCR檢測骨骼肌中病毒RNAFig.5 Semi-quantitative detect the viral RNA in skelet al muscle

骨骼肌與小腸的病理觀察結果見圖6(見彩插3)，與半定量PCR結果一致，陰性對照組的骨骼肌可見明顯的肌纖維變性與壞死，小腸絨毛間質水腫及上皮細胞空泡變性。VacA，VacC和VacD免疫組的幼鼠組織病變弱于陰性對照組，但是也可見到明顯的病變。而VacB與VacE組的幼鼠與滅活全病毒免疫組相同，組織未見明顯的病變。

以上結果表明，VacB與VacE兩組重組蛋白的幼鼠保護效果明顯，可以起到與滅活病毒相同的抗病毒保護作用。

3 討論

通過以上實驗，表達純化 EV71多肽鏈的亞單位肽段融合抗原，得到了五種重組蛋白作為備選疫苗;經過體內外保護性評價試驗，得到兩種具有較好保護性能的備選疫苗;結合與正常人腦免疫交叉反應的篩選，得到一株既無潛在神經毒性能力，又具有良好保護效果的疫苗:證明VacB可以應用于預防EV71感染的臨床研究。

進入上世紀九十年代，亞洲地區爆發的 EV71主要以C亞型為主，而中國大陸地區則以C4為主要流行亞型。CDC的檢測報告則表明，中國的EV71流行株保守性很高，未檢測到變異，病毒傳播過程中的保守性為制備具有長期保護效果的疫苗提供了可能［10，12］。

目前所報道的 EV71疫苗，主要是集中在滅活的全病毒疫苗或者EV71結構蛋白組成的病毒顆粒類似物［13，14］，傳統意義上的滅活病毒疫苗，由于包含病毒的全部功能性蛋白與核酸，而被認為存在一定的風險。通過我們的實驗證明，集中優勢抗原的亞單位疫苗將是取代全病毒疫苗的研制方向。

由于各重組蛋白分別與正常人腦組織細胞中可能存在相同或相似的抗原決定簇，抗體可能會與其結合而對人體產生潛在的神經毒性作用。因此，必須對作為備選疫苗的各重組蛋白進行安全性評價，即進行免疫組織化學試驗檢測人腦組織樣本的未知蛋白靶點，篩查排除可以與其發生交叉反應的重組蛋白。

VP1蛋白被認為集中了優勢的抗原決定簇，被用來制備亞單位疫苗。但是我們認為，VP1蛋白的體內保護性能遠不及全病毒滅活疫苗［15，16］。為進一步尋找潛在的優勢抗原決定簇位點，本實驗采用融合數個肽段的策略，表達了五種針對EV71的聯合亞單位融合抗原。五種抗原均以不可溶的包涵體形式表達，有利于去除來自于細菌中的內毒素。通過體內外的中和試驗，篩選出兩種具有良好保護效果的抗原:VacB和VacE。

VacB包含 VP4蛋白，VP3蛋白的 C端和 VP1蛋白的 N端。VacE包含 VP4蛋白，VP3蛋白的 N端和3D蛋白的N端。這就表明，除了VP1蛋白外，VP4蛋白，VP3蛋白與3D蛋白也具有潛在的優勢抗原決定簇。結合免疫組化實驗，證明VacB既具有良好的體內外保護效果，又無潛在的神經毒性，完全可以應用于臨床研究。

［1］Ho M.Enterovirus 71:the virus，its infections and outbreaks［J］.Microbiol Immunol Infect，2000，33(4):205－216.

［2］He YX，Fu D，Cao DZ，et al Critical care and therapy based different illness state of 80 patients with severe hand-foot-andmouth disease seen in Shenzhen［J］.Chin J Pediat，2009，47(5):338－343.

［3］Oberste MS，Penaranda S，Maher K，et al.Complete genome sequences of all members of the species human enterovirus A［J］.J Gen Virol，2004，85(Pt 6):1597－1607.

［4］Chen HF，Chang MH，Chiang BL，et al.Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71［J］.Vaccine，2006，24(15):2944－2951.

［5］杜月英，丁鋼強.中醫藥治療手足口病臨床研究［J］.浙江中醫藥大學學報，2008，32(3):343.

［6］He YQ，Yang H，Li LL，et al.Genotype analysis of enterovirus type 71 detected from patients with hand-foot-mouth disease in Shenzhen［J］.Chin J Epidemiol，2008，29(8):790－793.

［7］Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72:248－254.

［8］Reed LJ，Muench H.A simple method of estimating fifty percent endpoints［J］.Am J Hyg，1938，27:493－497.

［9］Arita M，Ami Y，Wakita T，et al.Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model［J］.J Virol，2008，82(4):1787－1797.

［10］Yang CF，De L，Yang SJ，et al.Genotype-specific in vitro amplification of sequences of the wild type 3 polioviruses from Mexico and Guatemala［J］.Virus Res，1992，24(3):277－296.

［11］朵建英，王衛，佟巍，等.腸道病毒71型(EV71)對 ICR小鼠的感染［J］.中國比較醫學雜志，2009 19(5):41－46.

［12］Li L，He Y，Yang H，et al.Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，People’s Republic of China［J］.J Clin Microbiol，2005，43(8):3835－3839.

［13］Li RQ，Chen LJ，Wang YM，et al Genetic characteristics of enterovirus 71 isolated in Beijing，2006－2008［J］.Chin J Epidemiol，2009，30(1):45－49.

［14］Chung YC，Ho MS，Wu JC，et al.Immunization with virus-like particles of enterovirus 71 elicits potent immune responses and protects mice against lethal challenge［J］.Vaccine，2008，26(15):1855－1862.

［15］Ong KC，Devi S，Cardosa MJ，et al.Formaldehyde-inactivated whole virus vaccine protects a murine model of Enterovirus 71 encephalomyelitis against disease［J］.J Virol，2009，84(28):661－665

［16］Wu CN，Lin YC，Fann C，et al，Ho MS.Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization with subunit VP1 vaccines and inactivated virus［J］.Vaccine，2001，20(5－6):895－904.

Preparation of Subunit Vaccine for Human Enterovirus 71

HAO Yi，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences，Peking Union Medical College and Chinese Academay of Medical Science，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministy of Health，Beijing 100021，China)

Objective To prepare the fusion subunit vaccine candidates against human enterovirus 71 by overexpression in prokaryotes，and to evaluate the protection effect of that by mice infection model.Method Fusion subunit peptides of EV71 was over-expressed in Escherichia coli and applied in female mice immunity.The female mice were then sent to mate and the neonatal mice were infected by EV71.The validity of vaccine candidates was evaluated by monitoring the virus copy number and histopathology in mice tissue.Result Five vaccine candidates:VacA，VacB，VacC，VacD and VacE were prepared through peptides fusion expression in E.coli，and most of these candidates showed significant protection effect against EV71 infection in vitro.Meanwhile，VacB and VacC didn’t show any cross reactivity to human brain tissue.However，both VacB and VacE could confer the ability to defense EV71 infection.Conclusion The subunit vaccines for EV71 were evaluated by mice infection model，two candidates:VacB and VacE show perfect protection effect both in vitro and in vivo.Furthermore，VacB doesn’t show any cross reactivity to human brain tissue and can be used as potential no neurological toxicity vaccine for clinical therapy.

Human enterovirus 71;Subunit fusion vaccine;Mice

R373.2

A

1671-7856(2010)06-0007-06

2010-03-08

圖3 兔疫組化檢測各重組蛋白的抗血清與正常人腦組織的交叉反應
注：A，陰性對照，大腸桿菌裂解上清；B，滅活病毒；C，VacA；D，VacB
Fig.3 Immunohistochemistry observation of the cross reactivity betWeen antigens and human brain tissue
Note:A， negative control， E.coli lysate; B， Inactivated virus; C， VacA; D， VacB

圖6 病理觀察攻毒后幼鼠的骨骼肌與小腸組織
注：A-D: 骨骼肌，E-H:小腸；A、E: 陰性對照，大腸桿菌裂解上清兔疫組；B、F:滅活病毒兔疫組；C、G: VacA 兔疫組；D、H: VacB 兔疫組；組織樣品來源于攻毒5 d后的幼鼠；箭頭指示：A、C: 骨骼肌肌纖維變性與壞死;E、F: 小腸絨毛上皮細胞空泡變性。
Fig.6 Histopathology observation of the skelet al muscle and small intestine in EV71 infected mice
Note: A-D， skelet al muscle，E-H:small intestine; A，E: negative control， E.coli lysate; B，F: inactivated virus; C，G: VacA; D，H: VacB; the samples Were isolated from the tissue of neonatal mice in 5 day after EV71 infection. ArroWs：A，C: degeneration and necrosis of skelet al muscle fiber; E，F: degeneration of small intestinal villus epithelial cell.

實驗動物技術平臺(2009ZX10004-402)。

郝翊(1983－)，女，碩士生，研究方向:病理學與病理生理學。E-mail:peggy83510@sohu.com

秦川，女，教授，博士生導師。