結核分枝桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白對小鼠巨噬細胞自噬功能的影響

趙 勇，師長宏，張彩勤，毛峰峰，白 冰，伍 靜，張 海

(第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

結核分枝桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白對小鼠巨噬細胞自噬功能的影響

趙 勇，師長宏，張彩勤，毛峰峰，白 冰，伍 靜，張 海

(第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

目的 研究結核分枝桿菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白對小鼠巨噬細胞自噬功能的影響。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬細胞后加入純化的重組ESAT6-CFP10融合蛋白，通過透射電鏡檢測自噬體的形成。提取細胞總RNA和蛋白，以實時定量RT-PCR及Western blot方法檢測自噬相關基因(atg)分子水平和蛋白表達水平。結果 ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬細胞自噬體的形成，并導致atg分子表達水平下降，其中atg8表達量下降最為明顯。結論 MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通過調控atg分子表達水平影響小鼠巨噬細胞自噬功能。

結核分枝桿菌;ESAT6-CFP10融合蛋白;自噬;自噬相關基因(atg)

自噬是巨噬細胞執行免疫防御的重要手段，通過自噬，入侵的病原微生物可被巨噬細胞殺滅［1］。研究發現自噬也是抵抗結核分枝桿菌(MTB)入侵的重要手段［2］，MTB入侵后被巨噬細胞內吞，在自噬相關基因(Atg)的調控下，來源于高爾基復合體、線粒體等細胞器蛋白成分組成新的膜性結構將MTB包裹，形成自噬體結構。自噬體形成后可與溶酶體融合，并借助于溶酶體酸性環境降解入侵的MTB，從而達到免疫防御的目的［3］。但在 MTB的致病過程中，MTB也會通過自身分泌的抗原影響自噬的形成，從而逃避巨噬細胞的免疫殺傷作用。ESAT6和CFP10蛋白是 MTB重要的毒力因子，參與MTB的致病過程，為了研究該蛋白對自噬形成的影響，本文檢測ESAT6-CFP10融合蛋白對小鼠巨噬細胞自噬形成及相關基因的表達情況，以了解該融合蛋白在MTB致病機理中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:BALB/c小鼠，18～22 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供［SCXK(陜)2008-002］。

1.1.2 試劑及菌株:RPMI 1640培養液、胎牛血清購自于 Gibco公司。RNA提取、RT-PCR試劑盒、RIPA裂解液購自于杭州天根生物科技公司。βactin抗體、IL-2及Syber Green實時定量試劑盒由西安舟鼎國公司提供。7H10培養基購自于 Becton Dicksion公司。小鼠淋巴細胞分離液由天津灝洋公司提供。MTB H37Rv菌株由本室保存。抗atg5多克隆抗體［4］及抗 atg8單克隆抗體由本室制備并保存。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬細胞分離、培養:頸椎脫臼法處死小鼠，無菌取出脾臟，研磨后按1∶2比例加入淋巴細胞分離液，4000 r/min離心20 min，吸取中間白膜層，Hank’s液洗脫3次，沉淀以含 10%FCS RPMI 1640培養液懸浮，加入6孔板，37℃ 5%CO2常規培養2 d，棄去懸浮細胞，貼壁細胞即為巨噬細胞。每孔中加入100 U IL-2刺激巨噬細胞增殖。

1.2.2 自噬體檢測:巨噬細胞培養至對數生長期后按 MOI=1∶10比例加入1×106CFU的 H37Rv菌株作用2 h，再加入25 μg/mL純化的 ESAT6-CFP10重組蛋白作用3 h，PBS緩沖液(pH7.4)洗脫三次以洗脫未結合的菌株。對照組細胞只加入等量H37Rv作用2 h。上述細胞以0.25%胰酶消化后收集細胞，20%鋨酸固定過夜，透射電鏡觀察自噬體的形成。

1.2.3 實時定量PCR檢測atg mRNA表達水平:根據 GenBank報道的 atg基因序列，分別設計 atg5、atg7、atg8、atg12特異性引物用于實時定量 PCR檢測。atg5 上游引物為 5′atgacagatgacaaagatg 3′，下游引物為 5′ctcataaccttctgaaagtg 3′;atg7 上游引物為 5′atgggggaccctggactgg 3′，下游引物為 5′gcagagtcaccatt gtag 3′;atg8 上游引物為 5′tcggagaagaccttcaag 3′，下游引物為 5′catgttgacatggtcagg 3′;atg12 上游引物為5′atgtcggaagattcagagg 3′，下游引物為 5′tttcttggtgtctcc gggag 3′。上述各組細胞收集后加入1mL TRIzol提取細胞總RNA并進行cDNA第一鏈合成。以cDNA為模板，加入 25 μL Syber Green進行 PCR反應，PCR反應條件為:94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進行30個循環。atg mRNA相對定量通過下列公式計算［5］:atg mRNA=2-△ct× 100。

1.2.4 Western blot檢測 atg5、atg8蛋白表達水平:收集細胞以RIPA裂解液提取細胞總蛋白。蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，將適當大小的已預先處理的PVDF膜與PAGE膠相貼，在恒壓100 V條件下轉移電泳1 h，50 g/L脫脂奶封閉后，分別加入1:50稀釋的鼠抗atg5多克隆抗體及atg8單克隆抗體，同時以 β-actin作為內參對照，4℃ 過夜，1 g/L Tween-20 PBS洗滌后，加入HRP標記羊抗鼠IgG抗體，37℃放置1 h。PBS洗滌后，加入底物液顯色。

2 結果

2.1 自噬體檢測

透射電鏡結果發現實驗組和對照組細胞均可觀察到自噬體典型形態，但在ESAT6-CFP10融合蛋白作用下，巨噬細胞中自噬體形成數目明顯減少，而對照組細胞中自噬體數目較多(圖1)，表明ESAT6-CFP10融合蛋白會對自噬體形成產生一定的影響。

2.2 atg mRNA表達水平

對照組細胞中 atg5、atg7、atg8、atg12表達水均高于實驗組，在 ESAT6-CFP10融合蛋白作用下 atg分子mRNA表達均下調，其中尤以atg8分子mRNA表達水平下降最為明顯(圖2)。

2.3 atg5、atg8蛋白表達水平

分別以抗atg5多克隆抗體及atg8單克隆抗體與感染細胞總蛋白進行反應，Western blot結果表明這兩種分子蛋白表達水平下降(圖3)，表明ESAT6-CFP10融合蛋白通過影響atg分子蛋白表達水平調控自噬體的形成。

3 討論

自噬是細胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體(autophagosome)，然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體并進行多種酶的消化及降解，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新［6］。自噬體及自噬現象的研究發現，自噬作用參與了機體對病原體入侵的免疫防御過程，是機體抵御病原入侵的重要防線。自噬在細胞防御中的作用之一就是清除入侵的病原體.盡管侵入細胞的細菌一般通過內吞被運送到溶酶體降解，但還是有一些病原體可以通過阻礙或改變吞噬體的成熟而逃脫宿主的防御機制。細菌在逃脫非吞噬細胞的內吞體后可以被自噬體內化、降解從而減少了細胞內具有復制能力的病原體。因此，自噬能夠保護機體免受細菌的侵襲。然而，還有一些細菌可以利用自噬這種機制進行復制。這些細菌經內吞進入細胞后并不通過吞噬作用被清除而是進入了具有自噬體特征的雙層膜結構內，它們將自己隱蔽其中并破壞自噬途徑。近年來，越來越多的研究表明，自噬在抗胞內細菌和病毒感染中發揮著天然免疫應答的作用:一方面自噬促進機體對胞內感染病原體的清除;另一方面，胞內感染病原體通過某些機制逃避機體的自噬［7］。在自噬體的形成過程中，一些自噬相關基因(autophagy related gene，atg)的表達，如 atg5、atg7、atg8、atg12等，對自噬的形成至關重要，其中 atg8分子表達的LC3蛋白是自噬形成的標志物［8］。

圖1 ESAT6-CFP10融合蛋白對自噬體形成的影響Fig.1 The effects on the formation of autophagy by ESAT6-CFP10 fusion protein

圖2 atg分子mRNA實時定量RT-PCR結果Fig.2 mRNA expression of of atg by real time RT-PCR

圖3 Western blot檢測 atg5，atg8分子表達水平Fig.3 Expression of atg5 and atg8 detected by Western blot

通過電鏡觀察自噬體的形成是研究自噬功能的重要手段，但在前期的研究中我們發現細菌感染巨噬細胞后可很快導致巨噬細胞發生凋亡，感染后4 h即可觀察到凋亡的發生，隨著作用時間的延長，細胞發生凋亡的程度越高。當凋亡發生時，電鏡下只能觀察凋亡形成的一些典型形態，而不能觀察到自噬體形成。此外，細菌感染巨噬細胞后2～3 h即可被巨噬細胞吞噬，因此基于以上考慮本研究將H37Rv毒株感染巨噬細胞時間控制在2 h，這樣既能觀察到自噬體的形成，又可保證細菌能被巨噬細胞吞噬。

致病性的MTB能在巨噬細胞中長期存活甚至大量繁殖，且在MTB的繁殖期伴有巨噬細胞大量地以壞死為主的死亡;而非致病性的MTB在感染巨噬細胞后能很快地被巨噬細胞所殺滅，同時伴隨巨噬細胞的大量凋亡。這提示我們毒力因子參與了對抗機體的防御機制，可能會通過抑制自噬途徑影響巨噬細胞的功能。研究發現MTB表達的ManLAM、pknG等毒力因子能阻斷吞噬體－溶酶體的融合過程［9］，而esat6/cfp10也是 RD1區重要的毒力基因，因此它們可能是MTB逃避機體免疫防御的重要因素。pknG與esat6有許多相似之處:①它們都是毒力因子，在無毒株中缺失，而只在毒株中表達;②都是早期分泌蛋白，且無前導信號肽序列;③分泌表達受ESX-1/snm型體系調控。esat6/cfp10分泌調控序列Rv3871已經證明了具有阻斷吞噬體－溶酶體融合的過程，因此有理由相信ESAT6-CFP10融合蛋白可能也參與了這一過程。此外，Pathak等［10］認為ESAT6蛋白通過TLR2結合到巨噬細胞表面后可抑制干擾素轉錄調控因子(IRFs)和NF-κB的激活，而NF-κB轉錄激活與自噬形成密切相關，因此ESAT6抑制NF-κB激活后也會影響自噬體的形成。本研究觀察了ESAT6-CFP10融合蛋白對小鼠巨噬細胞自噬體的影響，并初步探討其影響機制，結果發現該融合蛋白通過影響atg分子表達抑制巨噬細胞自噬體的形成，這可能是ESAT6-CFP10融合蛋白致病機理。

［1］Rich KA，Burkett C，Webster P.Cytoplasmic bacteria can be targets for autophagy［J］.Cell Microbiol，2003，5(7):455－468.

［2］Gutierrez MG，Master SS，Singh SB，et al.Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages［J］.Cell，2004，119(6):753－766.

［3］Leemans JC，Thepen T，Weijer S，et al.Macrophages play a dual role during pulmonary tuberculosis in mice［J］.J Infect Dis，2005，191(1):65－74.

［4］趙勇，栗文彬，師長宏，等.自噬相關基因Atg5的原核表達及多克隆抗體制備［J］.生物技術通訊，2009，20(4):482－484.

［5］劉方方，李一榮，陳風花，等.實時定量 PCR檢測 TRF1、TRF2和hRAP1基因在急性髓細胞性白血病中mRNA表達［J］.臨床血液學雜志，2009，22(8):405－409.

［6］張發仁，許麗艷，沈忠英，等.自噬的概述［J］.汕頭大學醫學院學報，2005，18(4):250－253.

［7］李寶華，熊思東.自噬對胞內感染病原菌的雙重作用［J］.微生物與感染，2006，1(3):181－183.

［8］Marino G，Lopez Otin C.Autophagy:molecular mechanisms，physiological functions and relevance in human pathology［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61(12):1439–1454.

［9］Nguyen L，Pieters J.The Trojan horse: survival tactics of pathogenic mycobacteria in macrophages［J］.Trends Cell Biol，2005，15(5):269－276.

［10］Pathak SK，Basu S，Basu KK，et al.Direct extracellular between the early secreted antigen ESAT－6 of Mycobacterium tuberculosis and TLR2 inhibitsTLR signaling in macrophages［J］.Nat Immunol，2007，8(6):610－618.

The Effects of Mycobacterium tuberculosis ESAT6-CFP10 Fusion Protein on the Function of Autophagy in Mouse Macrophages

ZHAO Yong，SHI Chang-hong，ZHANG Cai-qin，MAO Feng-feng，BAI Bing，WU Jing，ZHANG Hai
(Laboratory Animal Center of Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China)

Objective To study the effects of Mycobacterium tuberculosis ESAT6-CFP10 fusion protein on the autophagic function of mouse macrophages.Methods Macrophages of mouse were first infected with M.tuberculosis H37Rv，and then infected with ESAT6-CFP10 fusion protein.Transmission electron microscope was used to detect the formation of autophagosome.Total RNA and protein of infected macrophages were extracted and used to measure the expression levels of autophagy-related genes(atgs)by RT-PCR and Western blot.Results ESAT6-CFP10 fusion protein inhibited the formation of autophagosome in mouse macrophages，and the expression level of atgs also reduced，especially the atg8 had a significant reduction.Conclusion ESAT6-CFP10 fusion protein can inhibit the formation of autophagosome in mouse macrophages by the way of down-regulate the expression level of atgs to control the function of autophagy.

Mycobacterium tuberculosis(MTB);ESAT6-CFP10 fusion protein;Autophagy;Autophagy-related genes(atgs)

R379.91+1

A

1671-7856(2010)06-0013-04

2010-01-06

國家自然科學基金資助項目(30872359)。

趙勇(1984－)，男，助理實驗師，主要研究方向:感染性動物模型。

張海，男，副教授，主要研究方向:感染性動物模型。