滇南小耳豬精液的直接冷凍保存

鄭 紅，李 波，楊世華，陳麗玲，何保麗，角建林

(1.昆明醫學院，昆明 650031;2.昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650224)

滇南小耳豬精液的直接冷凍保存

鄭 紅1，李 波1，楊世華2，陳麗玲1，何保麗1，角建林1

(1.昆明醫學院，昆明 650031;2.昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650224)

目的 建立滇南小耳豬精液冷凍保存方法，加速云南省特有小型豬種的小型化選育。方法 利用脈沖電刺激模式誘導公豬輸精管自助收縮排精。利用直接冷凍新技術(DFM)研究不同冷凍方案對精子的運動度、精子頂體完整性和體內授精胚胎發育能力的影響。結果 在直接冷凍方法中，3%甘油防凍劑的作用下，60 s植冰時間和1.5mm/s的冷凍降溫參數對精子運動度保護良好，精子運動復蘇率達到61.7%。但是，3%乙二醇雖然與甘油一樣對精子的頂體完整性都有很好的保護作用，對精子運動度保護能力較差。此外，3%甘油、60 s植冰、1.5mm/s冷凍速度的直接冷凍的凍精解凍，移植到超數排卵的母豬子宮頸口實施人工授精，獲得卵的受精和胚胎發育潛能尚可。結論 玻璃管直接冷凍可以完成滇南小耳豬精子的冷凍保存。

滇南小耳豬;電刺激采精;精液冷凍保存;直接冷凍法;人工授精

豬精液冷凍保存與應用研究始于20世紀70年代［1］，國內的研究始于20世紀80年代［2］，但至今豬冷凍精液的生產與應用仍沒有其它家畜普及。其主要原因是豬精子對低溫特別敏感，在冷凍解凍過程中極易受到損傷，所以豬冷凍精液的生產、應用難度大，操作程序較復雜。然而豬精液冷凍對提高優秀種公畜的利用率，開展瀕臨絕種的優良品種的保種、育種工作等都有重要意義。

近年來，由以色列科學家發明的直接冷凍法(directional freezing Method，DFM)受到諸多關注，利用此項技術已經完成了大容量冷凍多種野生動物的精子，并成功實施了人工授精試驗［3－7］。本研究以滇南小耳豬的電刺激采集的精液為對象，采用直接冷凍法探討豬精子冷凍機理和方法，為將來成功實施商品化凍精生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

昆明醫學院實驗動物中心自繁封閉群云南滇南小耳豬，公豬3頭，15～24月齡，體重在25～48 kg;初情期母豬1頭，7月齡，體重32 kg。臨床檢測未見生殖器官的器質性變化。所有實驗動物在實驗期間采用單籠飼養，配方飼料喂養，適當補充青飼料［SYXK(滇)2005－0004］。

1.2 實驗儀器與藥品

美國 Lane Pulsator IV型(Lane mfg.inc.Denver.Co.)電刺激采精儀和直徑為30mm的直腸探頭。激光共聚焦顯微鏡(Confocal Microscopy，Carl Zeiss 510META)。以色列 MTG516冷凍 儀;MTG516冷凍儀專用的中空玻璃管(2mL)及膠塞。超數排卵激素PMSG和HCG來自寧波激素二廠，其他試劑購于美國SIGMA公司。

凍精稀釋液配方:葡萄糖 3.715 g;檸檬酸三鈉0.60 g;EDTA鈉鹽0.125 g;碳酸氫鈉0.125 g;氯化鉀 0.075 g;青霉素鈉0.06 g;硫酸鏈霉素 0.1 g;重蒸水定溶至100mL。pH值調整為7.2，再用0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃保存，一周內使用。使用時37℃預平衡。

防凍液配方:稀釋液∶卵黃∶甘油/乙二醇:OEP=76.5∶20∶3∶0.5(體積比)，使用時 5℃預平衡。防凍液儲存時間不超過兩周。

1.3 實驗方法

1.3.1 精液采集和檢驗:采用Lane Pulsator IV型電刺激采精儀通過直腸電刺激采精法獲得精液［8］。采集的精液經4～5層滅菌紗布過濾除去膠體雜質后，立即檢測精子質量，選取密度大于3.0×108個/mL、運動度大于 65%的樣本為試驗材料(2頭公豬)，37℃水浴30 min送抵實驗室。

1.3.2 精液稀釋和平衡程序:精液在室溫(22℃)下靜置5～10 min后，1200 r/min離心10 min，棄上清液，用配置好的稀釋液按33.3∶66.7的比例進行稀釋，將稀釋后的精液放于4℃的冰箱內，平衡1 h。檢查精子活力，取精子運動度在65%以上的精液進行冷凍。

1.3.3 精液直接冷凍法:使用MTG516冷凍儀和專用的中空玻璃管(2mL)及膠塞，將含有冷凍保護劑并平衡1 h的精液(20%(V/V)卵黃、3%(V/V)甘油/乙二醇、0.5%(V/V)OEP)裝入4℃預冷的中空玻璃管內，放置于 MTG516的 A艙內，設置主控表參數，使通道推進桿按照所設計的速率(Va)推動冷凍中空管通過A艙進入B艙，停留60 s完成植冰(seeding)過程，再以一定的速率(Vb)推動冷凍管通過B艙，并進入C艙。最后將C艙中已經完成冰晶生長的中空冷凍管投入液氮中保存。A艙的溫度為4℃，B艙 －70℃，C艙為－150℃。本實驗主要通過設計不同的 Vb(0.5mm/s、1.0mm/s、1.5mm/s、2.0mm/s、2.5mm/s)進行冷凍試驗。

1.3.4 精液解凍方法:將冷凍管從液氮中取出，置于空氣中60 s后，放入具有38℃溫水的解凍儀銅管中，停留90 s后，取出，倒出精液，并在室溫下1200 r/min離心10 min，去掉上清液，加入稀釋液進行稀釋，放置于 38℃、5%CO2培養箱中培養 10～30 min，檢測冷凍精子質量。

1.3.5 冷凍復蘇精子功能的檢測

1.3.5.1 精子的運動度:精子的運動度為運動精子的百分率，冷凍前和解凍復蘇后分別記數精子的運動度。取10 μL精子滴加到預熱37℃的干凈玻片上，在顯微鏡下記數活動精子的百分率。每次計數200個精子，并至少重復一次。計算精子運動度復蘇率:精子運動度復蘇率% =(復蘇精子運動度%×100)/冷凍前精子的運動度%。

1.3.5.2 頂體的完整率檢測:用熒光染料 FITCPNA(Invitrogen公司)標記頂體完整的精子，染色步驟參照Esteves等［9］的方法進行。新鮮或冷凍復蘇精子用DPBS洗滌后離心，棄上清液，均勻涂在干凈的玻璃片上，室溫干燥，再用無水甲醇4℃固定30 s，置于空氣中風干待測。染色時，加入用DPBS溶液配制的FITC－PNA，使染料濃度為40 mg/mL，避光孵育20 min，洗去多余染料后，加入抗淬滅劑，封片。在激光共聚焦顯微鏡(Confocal Microscopy，Carl Zeiss 510 META)下檢查，激發光波長490 nm，發射光波長515 nm。頂體完整的精子頭部被染成均勻的蘋果綠色，而頂體破裂精子頭部僅部分著色或不被染色。記數頂體完整精子占精子總數的百分率，每次至少計數200個精子。

1.3.6 解凍后精液人工授精和回收的原核期胚胎的體外發育試驗:將中空玻璃管的凍精(1管，2mL)解凍，并稀釋至10mL。將稀釋精液通過精子移植導管注入到1頭經過超排處理的母豬子宮頸口，完成授精過程。在hCG處理50 h后，采用常規方法，暴露輸卵管。用吸滿預溫(37℃)TL－Hepes沖卵液的20mL注射器從輸卵管子宮端向傘部方向刺入輸卵管沖胚，用15mL離心管收集沖卵液，38℃保存送實驗室。在體視顯微鏡下撿卵，用TL－Hepes液洗滌3次，在50 μL的PZM4胚胎培養滴中洗滌3次并培養［10］，培養環境設置為 38.5℃，5%CO2、5%O2、90%N2空氣的飽和濕度的培養箱。每天觀察和統計胚胎發育情況，間隔1 d換相同量新鮮培養液，培養至第 7 天為止［11］。

1.4 統計分析

2 結果

2.1 進樣速率對豬精子的冷凍保護的影響

調節植冰時間為60 s時，研究不同進樣速率對冷凍精子的影響。重復5次實驗結果發現，在甘油組中，進樣速率(0.5mm/s～2.5mm/s)對精子的冷凍復蘇的運動度有一定影響，速率為1.5mm/s的冷凍精子的運動度較其它組高(P＜0.05)，為49.6%，運動度復蘇率也達到61.7%(表1)。而乙二醇組中，各冷凍組的精子運動度及運動度復蘇率均很低。對頂體完整性研究發現，所有實驗組的頂體完整率均超過90%，與對照組(鮮精)相比差異不顯著(P＞0.05)(圖1)。

2.2 解凍精子的受精能力的檢測

本研究將中空玻璃管的凍精(1管，2mL)解凍，并稀釋至10mL，移植到1頭經過超排處理的母豬陰道與子宮的結合部位，待完成體內受精的時間后，從輸卵管中沖出已排出的卵子，監測卵子的受精比率和原核期胚胎的發育能力。結果顯示(表2)，解凍的精子均獲得了較高比例受精卵和發育到囊胚。

表1 不同進樣速率(Vb)對精子運動度的影響Tab.1 The effects of different speed levels pushing the sample into the freezing box on the ice seeding

表2 解凍精子人工授精和原核期胚胎的發育能力Tab.2 The developmental potential of pronuclear embryos fertilized by the－frozen－postthaw sperms in vivo

圖1 不同冷凍進樣速度和冷凍保護劑對冷凍精子頂體完整率的影響Fig.1 The acrosomal intergrit of postthawed sperms in DFM with 60 s seeding ice and 3%glycerol and EG

3 討論

Cordova［11］報道與 0.5mL 麥管中冷凍相比，在5mL麥管中冷凍對穿透、單精受精、多精受精、活力和正常頂體完整性沒有任何有害的影響。此后他又報道冷凍于5mL麥管中的精子比冷凍于0.5mL麥管精子的染色質明顯的穩定［12］。Saravia等［13］發現單個扁平袋子和多重扁平袋子(各自為54%和49%)中冷凍的精子比0.5mL塑料細管(38%)中冷凍的精子質膜完整率高，解凍后多重扁平袋子比0.5mL塑料細管每劑量中存在更多活精子。所以，提出大型細管和扁平袋子在生產實踐上更有廣泛應用的潛力。直接冷凍的儀器和方法是以色列科學家專門為大容量冷凍精液而設計的精子冷凍儀，可以冷凍2mL、5mL、8mL容量的精液，已經成功運用在野生動物，如大象［3］，犀牛［4］，馬［5］，兔［6］等，以及二次重復冷凍牛的精子［7］。在本研究中，雖然選用這些動物的冷凍參數，但是冷凍效果很差。經過試驗，調節植冰(seeding)的時間和樣品冷凍進樣速率可以大大增加了保護能力，這說明豬精子特殊性，已經對較長時間的植冰和冷凍的低耐受性。另外，從精子的頂體的完整性考慮，本方法十分有效，這與其他報道相似［10－13］。是否還有更多的提升空間，尚需要繼續調節各個參數，優化方案。

精子的熒光染色技術是近年來興起的染色技術，牛和豬精子頂體熒光染色結果與直線運動精子數、低滲腫脹試驗(HOST)等方法的結果高度相關，而且用電鏡技術也證實了染色檢測的可靠性［14］。本研究選用絡合異硫氰酸熒光素(FITC)植物凝集素－花生凝集素(PNA)。FITC具有熒光性，而與之相連的PNA可與頂體膜外的復合糖類相作用，頂體完整精子頂體部發強光，且邊緣光滑;頂體部分發熒光或無熒光，為頂體破損或完全破壞精子［15］。PNA與頂體膜外的復合糖的結合是特異性的，從而準確預測精子的受精能力［16－17］。

目前認為，最準確監測凍精的受精能力的方法是人工授精和體外受精，因為這也是凍精的主要目的。但人工授精的測試的試驗時間長，當由凍精實施人工授精所產生的新生動物出生方可得到說明，這一過程受到諸多因素的干擾影響，很難及時反映凍精的能力。而本研究中，選用超數排卵結合人工授精，監測卵子的受精和發育潛能，就可以可以在很短時間內得出可、比較可靠的結論。這種方法有望在將來凍精的監測中得到廣泛使用。本研究中，由于時間等關系，盡管實施人工授精和胚胎發育能力測試沒有重復試驗，凍精的受精胚胎的囊胚率可達到80%左右，這與對照沒有差異，也與已報道豬的相應結果沒有差異［18］

4 結論

本研究首次完成了滇南小耳豬精子的直接冷凍法冷凍，通過精子的運動度、頂體的完整性和人工授精及早期胚胎培養的三者結合檢測冷凍精液的效果。60 s植冰時間時，3%甘油對精子運動度保護良好，其中1.5mm/s的冷凍降溫參數的運動復蘇率達到61.7%，但3%乙二醇對精子運動度保護能力較差，雖然它與甘油一樣對精子的頂體完整性都有很好的保護作用。此外，60 s植冰、3%甘油、1.5mm/s冷凍速度的直接冷凍的凍精解凍，移植到超數排卵的母豬子宮頸口實施人工授精，獲得卵的受精和胚胎發育潛能尚可。本研究說明，玻璃管直接冷凍可以完成滇南小耳豬精子的冷凍保存，為將來體外受精研究和實現凍精用于生產實踐奠定了一定基礎。

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Cryopreservation of Sperms with Directional Freezing Method in Yunnan Diannan Miniature Pig

ZHENG Hong1，LI Bo1，YANG Shi－hua2，Chen LI－ling1，HE Bao－li1，JIAO Jian－lin1
(1.Laboratory Animal Center，KunMing Medical College，KunMing 650031，China;2.Bio－technique College，KunMing Engineering University，KunMing 650224，China)

Objective To establish the cryopreservation of sperm genetic source and to speed up the selection of a special－strain minipigs.Methods Boars anesthetized were preformed rectums electroejaculation with Lane Pulsator IV machine.The freeing method of sperms was directional freezing method(DFM)with different seeding ice duration(60 s)and different speeds of cooling(0.5～2.5mm/s).Results In cryopreservation with direct freezing method(DFM)，the parameters of 60 s seeding ice duration and 1.5mm/s cooling speed produced the better protection than others in the terms of the motility(61.7%)and acrosamal integrity of post thawed sperms.However，3% EG showed the deficient in potential of cryopreservation，though the acrosomal intergrity showed no difference with fresh sperms.The development potential of pronuclear embryos produced by the artificial insemination of frozen sperms with 60 s seeding duration and 1.5mm/s cooling speed was acceptable.Conclusion Directional freezing method can perform sperm cryopreservation and fertilization of ova in vivo and sequent embryos can develop to blastocyst stage.

Diannan miniature pig;Rectums electric ejaculate;Sperm cryopreservation;Directional freezing method;Artificial insemination

R332

B

1671－7856(2010)06－0061－05

2009－03－05

上海市科委項目(編號064909004);云南省教育廳項目(編號07Y10178)。

鄭紅，女，副教授，研究方向:實驗動物學。

角建林。E－mail:zh1995097@yahoo.com.cn