水飛薊有效成分的提取研究

董 巖， 孔春燕

(德州學(xué)院化學(xué)系，山東德州253023)

水飛薊(Silybum marianum L.Gaertn)是菊科水飛薊，屬草本植物，原產(chǎn)于南歐、北非［1］。是歐洲民間的一種草藥，用于治療肝膽疾病。我國早在20世紀(jì)50年代初就引入了水飛薊，但僅用于觀賞，直到20世紀(jì)60年代末以H.Wagner為代表的德國藥學(xué)家，對(duì)其有效成分進(jìn)行提取后，我國才將它作為一種保肝藥用植物推廣種植。

水飛薊素具有保肝、降血脂、抗氧化、防止糖尿病、保護(hù)心肌、抗血小板聚集和抗腫瘤等生理作用［2-10］。水飛薊素保肝作用的機(jī)制可歸結(jié)為對(duì)肝細(xì)胞膜的保護(hù)作用［2］、促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)［3］、再生功能和抗肝纖維化作用［4-5］;可以顯著降低外源性高脂血癥的膽固醇和甘油三酯［6］;康一凡證明水飛薊賓具有明顯的減輕脂質(zhì)過氧化損害的作用［7］;而Huseini等證實(shí)糖尿病病人每天服用SM 200 mg后，患者血糖明顯降低［8］;陳紅等實(shí)驗(yàn)證明水飛薊賓可以減輕缺氧、缺糖的心肌細(xì)胞的損傷，并可部分對(duì)抗異丙腎上腺素加重缺氧、缺糖心肌細(xì)胞的損傷作用［9］;另外有研究表明水飛薊素能明顯降低血小板黏附率［10］。

本文采用有機(jī)溶劑冷漬法、有機(jī)溶劑熱回流法和有機(jī)溶劑連續(xù)回流多次回收法對(duì)水飛薊有效成分進(jìn)行提取，通過對(duì)三種方法實(shí)驗(yàn)過程所得到的水飛薊有效成分的提取率進(jìn)行比較，探討水飛薊總黃酮和水飛薊賓精制的最佳實(shí)驗(yàn)方法。

實(shí)驗(yàn)部分

1 儀器與試劑

島津UV-2450 PC紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司);Nicolet IR 200傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司);DF-Ⅱ集熱式恒溫水浴磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);AL204 Mettler Toledo電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);(X-4型數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測定儀，北京泰克儀器有限公司)。

甲醇、無水乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、2，4-二硝基苯肼、氫氧化鉀、濃硫酸、氫氧化鈉均為分析純?cè)噭?，水飛薊種子(煙臺(tái)只楚藥業(yè)有限公司);

2 有機(jī)溶劑冷漬法提取水飛薊有效成分［11］

將干燥的水飛薊種子粉碎，過40目篩，用正己烷脫脂6 h左右，至脫盡為止。取10 g脫脂種子粉末，用無水乙醇在室溫下浸提3次，第1次用80 mL，第2次用50 mL，第3次用20 mL，每次浸提20 h。合并3次浸提液，減壓蒸餾回收乙醇，得黃色粉末狀物質(zhì)，加甲醇溶解，放置2 d后抽濾，取不溶物真空干燥，按5項(xiàng)所示方法測定水飛薊總黃酮含量，以mg/g脫脂種子表示。將浸提時(shí)間改為24 h(×3)，28 h(×3)，其余按上述操作進(jìn)行。用同樣的步驟以甲醇和丙酮代替乙醇作為溶劑進(jìn)行提取。

用乙醇做溶劑，取10 g未脫脂種子按上述操作進(jìn)行提取，結(jié)果以mg/g未脫脂種子表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，圖2。

圖1 不同溶劑提取脫脂種子中水飛薊總黃酮結(jié)果比較(冷浸法)

3 有機(jī)溶劑熱回流法提取水飛薊有效成分［12］

稱取10 g脫脂種子粉末9份，置于150 mL無水乙醇中，水浴加熱使乙醇沸騰，開始計(jì)時(shí)，每30 min取一份樣品稍冷過濾，減壓蒸餾回收乙醇，得黃色粉末狀物質(zhì)，加甲醇溶解，靜置2 d后抽濾，將所得產(chǎn)品干燥，按5項(xiàng)所示方法測定水飛薊總黃酮含量，以mg/g脫脂種子表示，測定9次。用同樣的步驟以甲醇和丙酮代替乙醇作為溶劑進(jìn)行提取。

用乙醇做溶劑，取10 g未脫脂種子按上述操作進(jìn)行提取，結(jié)果以mg/g未脫脂種子表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，圖4。

圖2 乙醇提取脫脂和未脫脂種子中水飛薊總黃酮結(jié)果比較(冷浸法)

圖3 不同溶劑提取脫脂種子中水飛薊總黃酮結(jié)果比較(有機(jī)溶劑熱回流法)

圖4 乙醇提取脫脂和未脫脂種子中水飛薊總黃酮結(jié)果比較(有機(jī)溶劑熱回流法)

4 有機(jī)溶劑連續(xù)回流多次回收法提取水飛薊素有效成分

取10 g脫脂種子粉末，用無水乙醇60 mL按索式法連續(xù)抽提總黃酮，從第1次虹吸開始計(jì)時(shí)，每80 min倒出燒瓶中收集的抽提液，并換新的乙醇繼續(xù)抽提，連續(xù)抽提3次，合并3次抽提液，減壓蒸餾回收乙醇，得黃色粉末狀物質(zhì)，加甲醇溶解，靜置2 d后抽濾，將所得產(chǎn)品干燥，按5項(xiàng)所示方法測定水飛薊總黃酮含量，以mg/g脫脂種子表示。將抽提時(shí)間改為60 min(×4)，40 min(×6)，其余按上述操作進(jìn)行。分別用甲醇和丙酮代替提取溶劑乙醇，按以上操作進(jìn)行提取。

5 水飛薊總黃酮的含量測定

水飛薊總黃酮的含量測定采用紫外吸收法［13］。

準(zhǔn)確稱取提取到的樣品0.15 g完全溶解于約20 mL甲醇中并倒入25 mL量瓶，稀釋到刻度，搖勻。用移液管吸取1.0 mL該溶液到10 mL量瓶中，另外準(zhǔn)備1.0 mL的甲醇作空白。分別向上述樣品溶液和空白甲醇中加入2 mL新鮮配制的2，4-二硝基苯肼溶液(將0.500 0 g的2，4-二硝基苯肼溶解在1 mL濃硫酸中，用甲醇稀釋到50 mL)，搖勻后，在50～55℃的水溶液中加熱反應(yīng)50 min。待以上兩溶液冷卻下來后用氫氧化鉀甲醇溶液(2.5 g氫氧化鉀溶解在7.5 mL水中，用甲醇稀釋到25.0 mL)稀釋到10 mL，充分混合。2 min后，將此混合溶液移取1 mL至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，充分搖勻，放置1 d后，用0.45μm濾膜過濾。

將已過濾的溶液在490 nm波長下(1 cm厚測量池)測量其的吸光度，用空白溶液做參考，取537為水飛薊賓2，4-二硝基苯肼衍生物的消光值E(1%，1 cm)時(shí)，按下列公式計(jì)算以水飛薊賓表示的黃酮類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù):

6 水飛薊賓的精制及鑒定

6.1 柱層析分離洗脫劑的選擇2 mg水飛薊素溶于少量乙醇，硅膠板點(diǎn)樣，分別用乙酸乙酯-甲醇(20∶1)、乙酸乙酯-石油醚(2∶1)展開，通過薄層色譜研究發(fā)現(xiàn)，最佳的展開劑為乙酸乙酯-石油醚(2∶1)，其中Rf=0.42。

6.2 柱層析分離水飛薊賓

將300～400目硅膠用石油醚攪拌均勻，用加料漏斗倒入硅膠柱中，壓實(shí);將4 g水飛薊素粉溶于甲醇溶液中，加入干硅膠，攪拌均勻后，將溶劑甲醇旋干。將得到的干燥硅膠倒入已裝好的硅膠柱中，用乙酸乙酯-石油醚(2∶1)進(jìn)行柱分離。整個(gè)柱分離過程用薄層色譜跟蹤。將合適試管中的展開劑旋干，干燥，得到白色粉末狀固體。

6.3 水飛薊賓的精制

水飛薊賓的精制常采用重結(jié)晶的方法［14］。

取4.0 g飛薊素，量取30 mL甲醇倒入燒杯中，加熱溶解，濾去不溶物，室溫放置2 d后抽濾，固體用少量甲醇洗3次，再用少量石油醚洗3次，減壓抽干，干燥后稱量所得產(chǎn)品的質(zhì)量。母液再在室溫下放置3 d后抽濾，干燥后稱量所得產(chǎn)品的質(zhì)量，兩次獲得的即是水飛薊賓粗品(白色微黃色松散顆粒)，計(jì)算其產(chǎn)率。分別用乙醇和丙酮代替甲醇按以上步驟進(jìn)行提取，并計(jì)算水飛薊賓的產(chǎn)率。所得結(jié)果列表1。

表1 重結(jié)晶方法精制水飛薊賓的結(jié)果

6.4 水飛薊賓的鑒定

分別取結(jié)晶物甲醇溶液1.0 m L，加少許鎂粉，振搖后，滴數(shù)滴濃鹽酸，在1～2 min內(nèi)呈現(xiàn)玫瑰紅色［15］;滴加氫氧化鈉溶液2滴，呈現(xiàn)深黃色［12］;滴加濃硫酸4～6滴，立即呈現(xiàn)暗紅色。三種顯色反應(yīng)均為陽性反應(yīng)，初步確定所得產(chǎn)品為水飛薊賓晶體。

狀態(tài):白色粉末，熔點(diǎn):151～152℃。(X-4型數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測定儀)

用島津UV-2450 PC紫外-分光光度計(jì)進(jìn)行紫外掃描，確定其最大吸收峰對(duì)應(yīng)波長。經(jīng)過測定可以得出，最大吸收峰位于287 nm，肩峰位于322 nm。與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［16］。

KBr壓片，用Nicolet IR 200傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描，測定分子中有關(guān)官能團(tuán)的吸收峰及頻率值。經(jīng)過測定可以得出:3 454，2 925，1 638，1 510，1 468，1 435，1 366，1 272，1 166，1 083，1 034，1 019，966，824 cm－1處有峰。與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［16］。

結(jié)果討論

通過對(duì)有機(jī)溶劑冷漬法、有機(jī)溶劑熱回流法和有機(jī)溶劑連續(xù)回流多次回收法提取水飛薊總黃酮的比較，可以發(fā)現(xiàn)冷漬法最大的好處是不需要加熱，可以節(jié)約資源，降低生產(chǎn)成本，但耗時(shí)較長，生產(chǎn)效率較低;熱回流法能大大加快提取速率，會(huì)消耗大量的能源，生產(chǎn)成本較高;而最好的方法則是連續(xù)回流多次回收法，與冷漬法和熱回流法相比較，這種方法使水飛薊總黃酮提取率明顯的提高了，同時(shí)此法由于減少了溶劑的相對(duì)使用量，從而比單純的熱回流法節(jié)約了部分能耗，降低了成本。

另外，通過比較3種溶劑可以看出，以乙醇作溶劑時(shí)，所得水飛薊總黃酮提取率最高，而丙酮和甲醇相差不大。還有，通過比較同一溶劑對(duì)脫脂種子和未脫脂種子提取率的高低可知，脫脂種子中水飛薊總黃酮較易提取。

水飛薊賓的精制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙酮產(chǎn)率最低，甲醇、乙醇兩種溶劑最終產(chǎn)率相差不是很大，考慮甲醇的毒性、成本等因素，我們選用乙醇作重結(jié)晶溶劑。

本次實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)相比有兩個(gè)方面的突破點(diǎn)。其一就是連續(xù)回流多次回收法的應(yīng)用，與普通熱回流法相比，這種方法使水飛薊總黃酮提取率明顯的提高了，同時(shí)此法由于減少了溶劑的相對(duì)使用量，從而比單純的熱回流法節(jié)約了部分能耗，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)降低成本具有重要意義;其二在于水飛薊賓精制方法的改進(jìn)，水飛薊賓在精制過程中傳統(tǒng)的脫色方法是采用活性炭吸附，本實(shí)驗(yàn)中為了提高水飛薊賓的得率，不采用活性炭，而是經(jīng)過多次重結(jié)晶使其達(dá)到較高純度，這種方法對(duì)工業(yè)生產(chǎn)中提高產(chǎn)率具有一定幫助。

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