酸棗仁合歡方抗抑郁最佳制備工藝的初步篩選

胡占嵩， 喬 衛， 李 陸， 劉婧姝， 符敬偉

(天津醫科大學藥學院，天津300070)

1 引言

抑郁癥是一類嚴重危害人類身心健康的精神疾病，其終生患病率為6.1%～9.5%，嚴重的抑郁癥患者中有15%的患者因自殺而結束生命。目前臨床使用的抗抑郁藥物長期使用副作用較大、療效降低，尚不能令人滿意。因此國內外抗抑郁藥的研制和開發方面越來越注重傳統中藥與中藥復方［1］。本市安定醫院以酸棗仁和合歡皮配伍的復方制劑進行抗抑郁治療，臨床療效顯著，有效率可達90%。我們在總結前人方劑的基礎上，確定以酸棗仁、合歡皮、白芍和柏子仁四味中藥組成酸棗仁合歡方［2］，研究其抗抑郁作用，并對其制備工藝進行初步篩選。旨在研制一種高效、低毒的抗抑郁中藥復方，為開發成為抗抑郁新藥打下前期工作基礎。

2 材料及試藥

2.1 儀器

BP211D十萬分之一分析天平(上海君達儀器廠);R204型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司);SHB-ⅢA循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);秒表(瑞士霍耶爾-奧利達斯廠);MC-3數字式溫度體溫計(奧姆龍(中國)有限公司)。

2.2 試劑

95%乙醇分析純;X-5大孔吸附樹脂，南開大學化工廠;AB-8大孔吸附樹脂，購于天津市海光華工有限公司 均為精品級。

2.3 實驗動物

♂性ICR小鼠80只，清潔級，體重(20±2)g購于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心，合格證號:SCXK津2005-0001。實驗前在實驗室飼養1周，適應環境。室溫(22±2)℃，相對濕度65% ～70%。光照12 h，自由飲食、攝水。

2.4 藥品

酸棗仁(Semen Ziziphi spinosae)、合歡皮(Cortex Albiziae)、白芍(Radix Paeoniae Alba)、柏子仁(Semen Platycladi)均購于天津太平大藥房，經天津醫科大學生藥教研室鑒定;鹽酸氯米帕明片(北京諾華制藥有限公司，批號:X0010，25 mg/片);利血平注射液(廣東邦民制藥廠有限公司，批號:061220，1 mL ∶1 mg)。

3 實驗方法

3.1 酸棗仁合歡方的不同制備工藝

酸棗仁合歡方由酸棗仁、合歡皮、白芍、柏子仁4種中藥按4∶2∶3∶2的配比制成，本實驗以傳統中藥提取方法為基礎，結合現代中藥提取技術，共設計以下4種不同制備工藝。

3.1.1 制備工藝1(水提法):將4味藥材用水煎煮2次(10，2 h;8，1 h)，合并煎液，減壓濃縮，備用。

3.1.2 制備工藝2(醇提法):將4味藥材用70%乙醇回流提取2次(10，2 h;8，1 h)，合并濾液，減壓濃縮至浸膏，備用。

3.1.3 制備工藝3(醇提法結合X-5大孔吸附樹脂):將制備工藝2所得浸膏以蒸餾水溶解，過X-5大孔吸附樹脂，分別用2倍量蒸餾水，3倍量70%乙醇洗脫，收集70%洗脫液，濃縮蒸干，備用［3］。

3.1.4 制備工藝4(醇提法結合AB-8大孔吸附樹脂):將制備工藝2所得浸膏以蒸餾水溶解，過AB-8大孔吸附樹脂，分別用2倍量蒸餾水，3倍量70%乙醇洗脫，收集70%洗脫液，濃縮蒸干，備用。

3.2 酸棗仁合歡方抗抑郁藥效學評價［4-5］

3.2.1 實驗動物給藥方案:將上述4種制備工藝所得供試品均按原藥材折算后給藥，實驗動物分組及給藥見表1。于每日上午9:00～10:00灌胃1次，連續灌胃14 d后進行測試。

表1 實驗動物分組及給藥方案

3.2.2 小鼠懸尾實驗:將小鼠尾部1～2 cm處的部分貼在一水平木棍上，使動物成倒掛狀態，其頭部離臺面約20 cm，懸掛兩側用板隔開動物視線。觀察6 min，并記錄后4 min內小鼠的不動時間為失望時間。

3.2.3 小鼠強迫游泳實驗:給藥方案同上，末次給藥后1 h進行實驗。實驗前小鼠訓練游泳6 min，24 h后測試:將小鼠放入水深10 cm的玻璃缸內(高20 cm，直徑14 cm)，水溫(25±2)℃。觀察6 min，記錄比較各組后4 min內小鼠的不動時間。動物不動行為的評判標準是小鼠微卷軀體，但保持垂直姿勢，鼻孔露出水面。

3.2.4 空場實驗:空場實驗由一個圓形的基座組成(直徑80 cm，高20 cm)，基座底部半徑14，28，42 cm處有3個同心圓，并被分為42個單位，不以墻壁隔開。將小鼠單獨放入圓心區域使其自由探索。記錄其3 min中內穿越，站立和修飾的次數。每只小鼠實驗后應用清潔劑將裝置清潔干凈。每只小鼠只進行一次實驗。

3.2.5 拮抗利血平誘發的小鼠體溫降低實驗:動物分組及給藥方案同上。體溫測定采用數字式電子體溫計。事先用少許硅油涂擦電子體溫計，使之潤滑，將體溫計探頭輕輕插入小鼠肛門1～2 cm，當溫度顯示穩定后記錄讀數，作為基礎體溫。之后灌胃給予相應藥物，1 h后腹腔注射利血平2.5 mg/kg，于注射后1，4及24 h測定體溫，以體溫降低值(ΔT=T基礎－T)作為指標，進行統計分析。

4 結果

4.1 酸棗仁合歡方不同制備工藝對小鼠懸尾不動時間的影響

各組小鼠懸尾不動時間與空白對照組比較結果見表2。結果表明，醇提高劑量組，X-5組和AB-8組均能顯著縮短小鼠不動時間，顯示出抗抑郁作用。其余組則未表現出抗抑郁作用。

4.2 酸棗仁合歡方不同制備工藝對強迫游泳小鼠不動時間的影響

各組小鼠游泳不動時間與空白對照組比較結果，見表2。從表中可以看出，水提組和AB-8組與空白對照組比較均能顯著縮短強迫游泳小鼠的不動時間，與陽性對照組比較在給藥后無顯著性差異(P>0.05)。其他組雖能不同程度地縮短強迫游泳小鼠不動時間，但并無顯著性差異。

表2 酸棗仁合歡方不同制備工藝對小鼠TST與FST實驗不動時間的影響(n=10;±s)

表2 酸棗仁合歡方不同制備工藝對小鼠TST與FST實驗不動時間的影響(n=10;±s)

注:與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

編號 組別 小鼠懸尾實驗累計不動時間/s小鼠強迫游泳實驗累計不動時間/s 1 空白對照組87.60±30.30 131.10±29.03 2 水提組 78.70±40.32 79.50±45.79*3 醇提組低劑量 86.50±31.81 97.90±58.82 4 醇提組中劑量 81.50±41.26 123.20±60.91 5 醇提組高劑量 56.30±26.11* 112.40±33.53 6 X-5組 42.60±24.73** 100.40±67.56 7 AB-8組 50.40±39.89** 77.50±38.63*8 陽性對照組 43.40±23.17** 72.00±55.25*

4.3 酸棗仁合歡方不同制備工藝在空場實驗中對小鼠自主活動的影響

實驗結果見表3。通過與空白對照組比較，各個給藥組和陽性對照組在小鼠自主活動，直立和修飾行為上均沒有統計學意義。由此可以排除因增強小鼠自主活動而引起的假陽性抗抑郁作用。

表3 酸棗仁合歡方不同制備工藝在空場實驗中對小鼠自主活動的影響(n=10;±s)

表3 酸棗仁合歡方不同制備工藝在空場實驗中對小鼠自主活動的影響(n=10;±s)

編號 組別 穿越格數 直立次數 修飾次數1 空白對照組139.80±50.97 11.00±12.53 1.50±0.97 2 水提組 115.40±55.47 8.40±6.80 1.50±1.08 3 醇提組低劑量 139.20±62.79 8.40±6.72 1.10±0.74 4 醇提組中劑量 110.00±61.88 8.00±7.45 1.60±1.27 5 醇提組高劑量 99.80±75.42 7.20±8.57 1.90±2.03 6 X-5組 125.40±44.76 15.70±8.41 1.70±1.42 7 AB-8組 125.60±52.35 10.70±10.07 1.60±1.17 8 陽性對照組126.70±57.89 7.10±7.53 1.00±0.82

4.4 酸棗仁合歡方不同制備工藝對利血平誘發小鼠體溫變化的影響

實驗結果見表4。從表中可以看出，空白對照組腹腔注射利血平4 h體溫明顯下降，且24 h后體溫回升不明顯。X-5組和AB-8組在4 h內具有明顯拮抗體溫下降的作用，其中AB-8組在24 h后體溫基本回復。陽性對照組雖能在一定程度上拮抗體溫下降，但與空白組比較并無顯著性差異，分析可能是AB-8組的拮抗體溫下降作用優于陽性對照藥物氯米帕明。

5 討論

5.1 抑郁癥發病機理較為復雜，且臨床癥候多樣，這恰與中藥復方的辨證施治原則相銜接，適合利用傳統中藥復方治療，便于發揮多環節、多途徑起效的特點，克服了經典抗抑郁藥物單一機制、療效不佳的缺點。

表4 酸棗仁合歡方不同制備工藝對利血平誘發小鼠體溫變化的影響(n=10;±s)

表4 酸棗仁合歡方不同制備工藝對利血平誘發小鼠體溫變化的影響(n=10;±s)

注:與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

編號 組別體溫變化值(ΔT=T基礎 －T)/℃1 h 4 h 24 h 1 空白對照組1.55±1.38 3.46±0.75 2.13±1.89 2 水提組 1.46±1.29 2.99±0.99 1.82±1.53 3 醇提組低劑量 0.32±0.92* 3.08±1.36 1.62±2.59 4 醇提組中劑量 0.94±1.38 3.28±1.39 2.79±1.38 5 醇提組高劑量 2.17±1.76 3.49±0.34 3.22±0.57 6 X-5組 －0.44±1.38**2.64±1.20 1.62±2.13 7 AB-8組 －0.11±1.36**2.14±1.44** 0.80±2.02 8 陽性對照組0.44±0.67 2.90±1.32 2.30±1.62

5.2 本實驗將中藥成方制備工藝與藥效學實驗相結合，以動物體內藥效指標為指導，篩選中藥成方制備工藝，可保證最佳制備工藝的有效性［6］。藥效學實驗采用小鼠強迫游泳實驗、懸尾實驗、拮抗利血平所致的體溫降低等抑郁經典實驗模型，反映了動物的絕望行為，可模擬人類的抑郁狀態。實驗結果顯示，酸棗仁合歡方AB-8組在各實驗中均表現出良好的抗抑郁活性，且無假陽性抗抑郁作用存在，初步認定醇提取法結合AB-8大孔吸附樹脂提取工藝為酸棗仁合歡方抗抑郁最佳制備工藝。以上結果為酸棗仁合歡方臨床用于治療抑郁癥打下了前期工作基礎。

5.3 復方中藥制備工藝的選擇應具有一般性，即所設計的制備工藝應是常規的，具代表性，兼顧不同濃度水平。本研究制備工藝選擇三種方式:其一為中藥傳統湯劑水煎煮工藝;其二為以醇提為主的常規提取工藝;其三為運用大孔吸附樹脂等現代技術的提取工藝［6］。根據本處方中各藥材的有效成分和有效部位多為皂苷和黃酮類化合物，以及我們的前期工作基礎，選取了具有代表性的中等極性AB-8和非極性X-5型大孔吸附樹脂，適合于工業化生產。

5.4 建立理想抑郁動物模型對探明抑郁癥病因、病理過程，以及研究有效治療藥物極為重要。抑郁癥的發生，是生化、遺傳、社會環境之間相互作用的結果，而目前的各種抑郁癥動物模型，只能表現抑郁癥某一方面的癥狀，各種抑郁模型發生的病理生理機制各異，對已知的抗抑郁藥作用都有不同程度的選擇性。本實驗中所應用的陽性對照藥氯米帕明屬三環類抗抑郁藥，具有阻斷中樞神經系統單胺神經遞質再攝取的作用，從而發揮抗抑郁作用。利血平是一種囊泡再攝取抑制劑，它使遞質留在囊泡外，易被單胺氧化酶降解，從而使單胺類遞質(去甲腎上腺素、5-HT、多巴胺)耗竭。因此該類陽性對照藥在利血平拮抗體溫下降模型中作用較差。由此可見，在抗抑郁藥物的實驗研究中，應同時聯合應用幾種抑郁模型，盡可能提高實驗結果的可信性。

5.5 實踐表明，以酸棗仁和合歡皮配伍的復方制劑進行抗抑郁治療，臨床有效率可達90%。本研究在總結前人方劑和臨床實踐的基礎上確立了酸棗仁合歡方。通過以上藥理模型進行的抗抑郁初步實驗驗證，結果表明，該方抗抑郁療效顯著，效果等同或優于陽性對照藥物，我們將繼續對其有效部位最佳配伍及質控方法進行研究，最終開發成為具有高效、多靶點、低毒、整體調節作用的中藥抗抑郁二類新藥，為中藥復方的二次開發以及臨床應用提供參考。

［1］喬 衛，周 晶，段宏泉.治療抑郁癥的中藥組合物及其制備方法:中國，101347524A［P］.2009-1-21.

［2］黨海霞，劉新民.抗抑郁中藥研究進展［J］.中國現代中藥，2008，10(4):35-39.

［3］郭麗冰，王 蕾.常用大孔吸附樹脂的主要參數和應用情況［J］.中國現代中藥，2006，8(4):26-32.

［4］徐叔云，卞如濂，陳 修，等.藥理實驗方法學［M］.北京:人民衛生出版社.2003:807.

［5］Peng W H，Lo KL，Lee Y H，et al.Berberine produces antidepressant-like effects in the forced swim test and in the tail suspension test in mice［J］.Life Sci，2007(81):933-938.

［6］武孔云，梁光義，陳 慶，等.中藥復方藥效物質基礎研究的思路及方法［J］.世界科學技術-中醫藥現化，2003，5(6):13-15.