博落回中生物堿對5種皮癬真菌抑制作用的初步研究

田 晶， 郁建平， 葛永輝， 齊柳婭， 李春梅

(貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025)

紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)，許蘭黃癬菌(Trichophyton schoenleini)，玫瑰色癬菌(Trichophyton rosaceum)，須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)，絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)是人源的皮膚癬菌，能引起常見的皮膚淺部真菌，如手癬、足癬、頭癬等。目前常見的治療皮膚真菌的主要有酮康唑，伊曲康唑等化學用藥，雖然在抑制皮癬真菌有一定的作用，但對于真菌病卻不能起到很好的根治作用。因此，篩選植物中有抗真菌活性的成分，具有一定的研究意義。博落回(Macleaya Cordata(Willd)R.Br)是罌粟科博落回屬(Macleaya R.Br)植物，研究表明，博落回中含有豐富的生物堿并具有重要的藥理活性［1，2］。目前對于博落回的研究主要集中在提取純化工藝以及藥理作用方面，在農藥以及獸藥方面有一定的應用［3］。民間有以博落回全草入藥，主治惡瘡及皮膚病［4］。本研究對博落回生物堿的抗皮癬真菌活性進行測定，目的在于對開發博落回應用于皮膚用藥方面提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗供試菌種 紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、許蘭黃癬菌(Trichophyton schoenleini)、玫瑰色癬菌(Trichophyton rosaceum)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)均購自中國醫學科學院皮膚病研究所。

1.2 實驗藥品 博落回生物堿，自制，含量約為70%，鹽酸血根堿純品(sigma公司)，白屈菜堿純品(sigma公司)，復方酮康唑軟膏(7 g):(批號:090321，廣東順峰藥業有限公司)。

2 方法

2.1 博落回生物堿的制備 取博落回全草，粉碎，室溫下用0.5% 鹽酸滲漉，合并滲漉液，調節pH約為3，通過預先處理好的強酸型陽離子樹脂，上柱，洗脫，濃縮，得到博落回生物堿，樣品為淡黃色粉末，生物堿含量約為70%。

2.2 培養基的制備 采用沙氏培養基:蛋白胨10 g，瓊脂 20 g，葡萄糖 40 g，蒸餾水 1 000 mL，121 ℃滅菌30 min，未調pH。其它:水瓊脂:瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL;0.1% 吐溫-80生理鹽水。

2.3 待測物的配置 抑菌試驗配置50 mg/mL的博落回生物堿溶液，10 mg/mL的血根堿鹽酸鹽溶液以及10 mg/mL的白屈菜堿溶液。抑制率實驗將博落回生物堿配制成 20、10、5、4、3 mg/mL 的溶液各25 mL。最低抑菌濃度實驗將博落回生物堿配制成48、24、12、6、3 mg/mL 的溶液各 10 mL。溶劑為40%二甲基甲酰胺溶液。

2.4 菌懸液的制備 將試管斜面的菌種接種于平板中，28～30℃培養7 d，活化菌種。將已活化的菌種接種于試管斜面內，28～30℃培養7 d。用0.1%吐溫生理鹽水洗孢子，調節孢子懸液在低倍鏡下(15×10倍)下每視野80～100個左右孢子。

2.5 抑菌實驗 制備雙層培養基，采用瓊脂打孔法［5］。將已滅菌的水瓊脂10 mL熔化后趁熱倒入9 cm直徑的培養皿中。待水瓊脂凝固后，將已融化的10 mL沙氏培養基冷至約50℃左右，迅速吸取1 mL菌液加入培養基內，充分混勻后，倒入已凝固的水瓊脂上。每種菌液各制作3個含菌瓊脂平板，待充分凝固后，用滅菌的打孔器在每個瓊脂平板上打3個孔，第一種瓊脂平板中的孔中分別加入40μL博落回生物堿溶液、陽性藥液、空白溶液;第二種中加入鹽酸血根堿溶液、陽性藥液、空白溶液;第三種中加入白屈菜堿溶液、陽性藥液、空白溶液，置28℃培養箱中培養一周。重復4次，測量抑菌圈。

2.6 抑制率測定 平板稀釋法［5］，將已經配制好的博落回生物堿溶液，濃度分別為 20、10、5、4、3 mg/mL，各吸取2 mL于滅菌的三角瓶中，加入13 mL滅菌后并冷卻至50℃左右的培養基，立即搖勻倒入培養皿內凝固。最終培養基內的博落回生物堿溶液的濃度分別為 2.67、1.33、0.67、0.53、0.4 mg/mL。另外，吸取2 mL 40% 二甲基甲酰胺溶液置于已滅菌的三角瓶中，加入13 mL滅菌并冷卻的培養基，倒入培養皿中做空白對照。用打孔器分別在5種供試菌中生長旺盛的菌落邊緣打取直徑為0.5 cm的菌圓片，移至含藥液的瓊脂平板中央，置28℃培養箱中培養一周。重復4次。7 d后觀察菌落直徑，取平均值，計算平均抑菌率。按下式計算抑菌率:菌落直徑(mm)=測量菌落直徑－5(mm)，抑菌率(%)=(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

2.7 最低抑菌濃度(MIC)值的測定 固體培養基稀釋法［5］，將48 mg/mL的博落回生物堿溶液用滅菌蒸餾水分別稀釋成 24、12、6、3 mg/mL的藥液。分別取每種濃度的藥液1 mL，加入14 mL滅菌并冷卻至60℃的沙氏培養基，立即搖勻倒入培養皿內凝固。博落回生物堿的終濃度分別為3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/mL。另外，吸取1 mL 40% 二甲基甲酰胺溶液，加入14 mL滅菌并冷卻的培養基，倒入培養皿中做空白對照。用接種環蘸取供試菌液在已凝固好的培養基上進行劃線培養，置28℃培養箱中培養7 d。重復4次，觀察結果。

3 結果

3.1 博落回生物堿、血根堿、白屈菜堿抑菌比較結果顯示:血根堿對除了對須癬毛癬菌無抑制作用，對紅色毛癬菌的抑制作用相對較差外，對許蘭黃癬菌、玫瑰色癬菌、絮狀表皮癬菌，均有良好的抑制效果，其中尤其對玫瑰色癬菌的抑制效果明顯。白屈菜堿對紅色毛癬菌以及玫瑰色癬菌無明顯抑制作用，對許蘭黃癬菌、絮狀表皮癬菌、須癬毛癬菌均有一定的抑制作用，且效力相當。博落回總生物堿對于5種皮癬真菌均有抑菌效果。具體結果見表1。

表1 博落回生物堿，血根堿鹽酸鹽，白屈菜堿對5種皮膚癬菌抑菌效果(抑菌圈直徑:mm，±s，n=4)Tab.1 The anti-fungus activaties of the compounds from Macleaya cordata

表1 博落回生物堿，血根堿鹽酸鹽，白屈菜堿對5種皮膚癬菌抑菌效果(抑菌圈直徑:mm，±s，n=4)Tab.1 The anti-fungus activaties of the compounds from Macleaya cordata

注:Tru:紅色毛癬菌，Ts:許蘭黃癬菌，Tro:玫瑰色癬菌，Ep:絮狀表皮癬菌，Tm:須癬毛癬菌。/表示無明顯的抑菌圈。

待測物 試驗菌種Tru Ts Tro Ep Tm博落回生物堿12±2.4 9±1.4 25±1.6 18±2.2 15±1.4血根堿 5±0.8 13±0.8 30±2.7 15±1.6 /白屈菜堿 / 18±1.4 / 11±1.8 10±0.8復方酮康唑10±1.4 11±2.2 23±2.8 20±1.6 13±1.8

3.2 不同濃度博落回生物堿對5種皮癬真菌生長的抑制作用比較 結果顯示:在博落回生物堿濃度分別為2.67mg/mL及1.33mg/mL時，對紅色毛癬菌、許蘭黃癬菌、絮狀表皮癬菌、玫瑰色癬菌、須癬毛癬菌的抑制率均達到100%，抑菌效果顯著。當濃度為0.67 mg/mL時，博落回生物堿對這5種生物堿的抑制率均在70%以上，對玫瑰色癬菌的抑制率達到90%以上。但在濃度為0.4 mg/mL時，對于絮狀表皮癬菌的抑制率低于30%，相對其它真菌的抑制率而言，其抑菌效果較差。具體結果見表2。

表2 博落回生物堿對5種真菌的抑制率(±s，n=4)Tab.2 The inhibition rate of 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

表2 博落回生物堿對5種真菌的抑制率(±s，n=4)Tab.2 The inhibition rate of 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

注:表內數字為抑制率(%)，—表示沒有真菌生長，抑制率為100%。

供試菌種博落回生物堿2.67 mg/mL 1.33 mg/mL 0.67 mg/mL 0.53 mg/mL 0.4 mg/mL Tru— —70.6±1.4 64.7±3.4 62.4±1.9 Ts — — 71.0±2.5 64.5±2.0 58.1±1.5 Ep — — 72.2±2.9 44.4±2.3 27.8±1.4 Tro — — 91.1±1.9 78.1±3.4 75.0±3.4 Tm— —86.7±3.1 83.3±2.3 76.7±2.8

3.3 博落回生物堿的最低抑菌濃度(MIC)測定結果顯示:博落回生物總堿對紅色毛癬菌、許蘭黃癬菌以及絮狀表皮癬菌的最低抑菌濃度均為1.6 mg/mL，對玫瑰色癬菌、須癬毛癬菌的最低抑菌濃度為0.8 mg/mL。由結果可知，博落回生物堿作為植物源天然抗真菌劑，效果明顯。空白組的結果為真菌大量生長，說明博落回生物堿的的抗菌活性較好。具體結果見表3。

表3 博落回生物堿最低抑菌濃度(M IC)值(x=Σxi/n，n=4)Tab.3 The M IC test for 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

4 討論

研究結果表明，博落回生物堿具有顯著的抑制皮癬真菌的作用，而博落回生物堿中的血根堿和白屈菜堿雖然也有一定的抑制皮癬真菌的作用，但其總體效果不及博落回生物堿。博落回在全國廣泛分布，資源容易獲得，其所含的生物堿也較容易提取。民間已將博落回酊劑用來治療手足癬。我們可以利用博落回豐富的資源，針對其對皮癬真菌良好的活性，將博落回生物堿開發利用為治療皮膚病的劑型，這將具有廣闊的市場前景和意義。

［1］胡之壁，徐 垠，馮勝初，等.博落回果實中有效成分的研究［J］. 藥學學報，1979，14(9):53.

［2］高尾樽雄，安本幸.罌粟科植物博落回生物堿的研究［J］.藥學雜志(日)，1973，93:242.

［3］周順玉.博落回浸提物對茶毛蟲、茶尺蠖的生物活性［J］.安徽農業科學，2007，35(5):1408.

［4］宋有林.博落回酊劑治療手足股癬30例［J］.中醫外治雜志，2000，5:41.

［5］周立剛.植物抗菌化合物［M］.北京:中國農業科技出版社，第一版，2005:10.

［6］鄭鈞鏞.藥品微生物學及檢測技術［M］.北京:人民衛生出版社，1989.