均勻設計和回歸分析優選菟絲子酒炙工藝

李春雨， 李彥明， 王 樹， 薛貴平， 張丹參

(1.河北北方學院，河北張家口075000;2.河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000)

菟絲子始載于《神農本草經》，列為上品，是常用補益中藥，具有補腎益精，養肝明目，安胎之功效［1］，其主要成分有黃酮、多糖、糖苷、氨基酸及微量元素等［2］。由于其質地堅硬，不利于粉碎和煎煮出有效成分，故臨床多以炮制品入藥。菟絲子歷代炮制方法有黃精汁浸、鹽炒、酒蒸、酒浸炒、清炒等十余種。現代研究也取得一定進展，張素茂［3］以浸出率為指標研究高壓蒸煮法炮制菟絲子的可行性。曾詮［4］以總黃酮為指標，比較了鹽炙、酒炙、炒黃3種炮制方法。李波［5］用正交設計以總黃酮為指標優選了菟絲子黃酒炮制工藝。田樹革［6］對菟絲子鹽炙品及100～160℃之間的烘制品中黃酮及多糖含量進行了比較研究。黃繼全［7］對菟絲子的生品、不同方法炮制品的水浸出物做了比較研究。張德昌等［8］對藥典中菟絲子所規定的“鹽炙法”炮制提出商榷，認為“酒炙法”比“鹽炙法”更具臨床實用意義。但是菟絲子酒炙的要求僅有具酒氣等經驗指標，沒有其酒炙飲片客觀科學的炮制工藝和質量標準。本實驗采用均勻設計和回歸分析優化菟絲子酒炙工藝，為合理利用其炮制品提供依據。

1 儀器與試藥

UV-2100紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司);102-3型遠紅外線快速干燥箱(北京興爭儀器設備廠);JN-5200D超聲波清洗器(寧波江南儀器廠);DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器(金壇市醫療儀器廠);蘆丁對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號是100080-200707);無水葡萄糖對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號是:110833-200503);市售紹興黃酒;試驗中所用菟絲子購自河北安國藥材市場，經我院藥學教研室高級實驗師薛貴平鑒定為旋花科植物Cuscuta chinensis Lam的干燥成熟種子。其他所用試劑均為分析純。

2 試驗方法與結果

2.1 均勻試驗設計 菟絲子酒炙工藝考慮的影響因素有加酒量，悶潤時間，烘制溫度，烘制時間，以總黃酮，總多糖，水浸出物，醇浸出物為指標，每個因素安排9個水平，應用均勻設計U9(94)表安排試驗，因素水平見表1。

2.2 藥材炮制操作過程 取100 g凈菟絲子藥材，加入一定比例的黃酒拌勻，密閉悶潤，然后置于恒溫箱中加熱至設定時間，取出放涼。粉碎過60目篩，備用。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品10.4 mg置50 mL量瓶中，加乙醇適量，稍加熱助溶，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 均勻設計因素水平表

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取樣品粉末1 g，加95%乙醇30 mL，超聲提取1 h，濾入50 mL量瓶中，殘渣以5 mL乙醇洗滌3次，合并濾液至量瓶中，加乙醇至刻度。

2.3.3 標準曲線的繪制［6］502 nm處測定吸收度，以吸收度為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程是Y=89.001X－2.317 7，r=0.999 1，結果表明在20.8～72.8μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 重復性試驗 分別精密稱取同批號生品6份如前供試品溶液制備及測定法操作，測得平均含量為2.75%，RSD=2.31%(n=6)。

2.3.5 精密度試驗 將對照品溶液連續測定6次，測得吸收度均值為0.498 6，RSD=0.11%，(n=6)。

2.3.6 穩定性試驗 將樣品溶液在0、15、30、45、60、75 min依法測定，平均含量為2.67%，RSD=2.12%，結果表明供試品溶液在75 min內穩定性良好。

2.3.7 加樣回收試驗 精密吸取已知含量的凈菟絲子供試品溶液共6份，分別加入0.21 mg/mL對照品溶液 1.0 mL，依法測定，計算回收率為100.2%，RSD為2.24%，結果見表2。

表2 加樣回收試驗表(n=6)

2.3.8 供試品溶液測定 精密吸取供試品溶液1.0 mL，照標準曲線制備項下方法操作，代入回歸方程計算含量，結果見表3。

表3 均勻設計用表和實驗結果

2.4 多糖含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品15.2 mg置25 mL量瓶中，加適量蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2 標準曲線的繪制［6］492 nm處測定吸收度，以吸收度為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程是Y=119.89X－6.283 7，r=0.999 6，結果表明在12.16～85.12μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4.3 供試品中多糖含量測定 將提取總黃酮后的殘渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次，每次5 mL，合并濾液與洗液，放冷，轉移至100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取0.3 mL，照標準曲線的制備項下的方法，自“加水至2.0 mL”起，依法測定，代入回歸方程計算即得。結果見表3。

2.5 水、醇浸出物測定 參照2005版藥典附錄Ⅹ項下熱浸法進行測定，結果見表3。

3 試驗結果與數據分析

3.1 均勻設計用表和實驗結果 采用中國均勻設計學會和東北制藥總廠共同研制的“均勻設計軟件包”處理數據，將試驗結果通過二次多項式逐步非線性回歸分析，建立回歸模型，結果見表4和模型擬和對比圖1。

表4 二次多項式逐步非線性回歸結果

圖1 回歸方程擬和對比圖

F檢驗表明，回歸方程1，3，4在α=0.01的水平上，回歸方程2在α=0.03的水平上均為顯著;從剩余標準差來看，4個響應模型均具有良好的預測精度，大小順序為1>3>4>2;比較回歸方程擬合對比圖，四個圖中的樣本值和擬合值均具有較好的擬合精度，A，B，C圖優于D圖;此外，模型的決定系數也表明回歸方程具有較高的預測精度。故使用該統計模型預測菟絲子酒炙工藝參數對其炮制的影響是可行的。

3.2 工藝條件的優化 通過對試驗模型各指標逐一優化，得到理論最佳組合值及預測值，然后根據回歸方程做出等值線圖，進一步分析各因素對每項指標的影響，結合實際試驗具體情況確定最佳工藝指標。具體分析如下:① 總黃酮:X4對結果影響最顯著，其次是X3，隨著烘制溫度升高、烘制時間延長有利于其含量提高。但是從性狀上來看高溫度導致焦色較深，焦香味較重，酒味較微，故溫度不宜過高。②總多糖:X2和X4交互作用對結果影響最顯著，其次是X3，隨著悶潤和烘制時間延長含量增大，其次是溫度降低有利。③ 水浸出物:X3對結果影響最顯著，其次是X1，X4，說明加酒量增多、烘制溫度升高、烘制時間延長含量增大。④醇浸出物:X3和X4交互作用最強，即隨著烘制溫度的降低和烘制時間的延長而增大，其次是X1和X2對結果的影響是隨著加酒量的增大與悶潤時間的延長而增大。

綜合分析，為了保證四項指標都能取相對較大值，得到最優工藝條件為 X1=30%，X2=9，X3=100，X4=60。

3.3 驗證試驗 取100 g藥材3份，按優化后的條件進行實驗，測定總黃酮、總多糖、水浸出物和醇浸出物的含量為2.93%、33.35%、30.5%和15.5%。

4 討論

4.1 本實驗采用總黃酮、總多糖以及水、醇浸出物四項量化指標，綜合評判了菟絲子酒炙的炮制工藝，使其火候評判客觀化，克服傳統單憑經驗判斷火候因人而異的主觀性，使其方法更加科學、合理和可行。

4.2 經驗證的最佳炮制工藝各項指標與優化后的理論值較接近，與其它炮制方案結果相比占優。最終得到菟絲子最優酒炙工藝參數為:加酒量30%，悶潤時間9 h，烘制溫度100℃，烘制時間60 min。說明通過均勻設計試驗和回歸分析，建立的主要指標回歸模型具有較高的精確度和顯著性，且通過回歸模型和等值線圖的直觀分析，利于求得最佳工藝參數，可作為優化本類炮制工藝的分析手段，為其他相關炮制工藝提供參考，為合理利用菟絲子炮制品提供依據。

［1］南京中醫藥大學編著.中藥大辭典［M］.第2版.上海:上海科學技術出版社，2006.

［2］郭洪祝，李家實.南方菟絲子化學成分研究［J］.北京中醫藥大學學報，2000，23(3):20.

［3］張素茂.高壓蒸煮法炮制菟絲子［J］.中國中藥雜志，1992，17(9):536.

［4］曾 詮，杜文清，吳洪元，等.菟絲子炮制研究［J］.中草藥，1998，29(10):667-668.

［5］李 波，金承勇.正交法優選菟絲子黃酒炮制工藝［J］.中成藥，2003，25(1)43-45.

［6］田樹革，周曉英，肖新芳，等.菟絲子及不同炮制品中有效成分含量的研究［J］.新疆醫科大學學報，2001，24(1):68-70.

［7］黃繼全.菟絲子炮制工藝探討［J］.江西中醫學院學報，2006，18(1):36.

［8］張德昌，曹谷珍.對藥典中菟絲子炮制方法的商榷［J］.中醫藥研究，2001，17(1):50.