花椒揮發油的多指標均勻試驗數據的提取優化工藝研究

崔紅花， 趙英日， 沈志濱﹡， 丁金龍， 尹永芹， 陳 超

(1.廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006;2.廣州中醫藥大學國際學院，廣東廣州510405)

花椒為蕓香科植物青椒Zanthoxylum Schini folium Sieb.et Zucc.或花椒 Zanthoxylum bungeanun Maxim.的干燥成熟果實，其味辛，性溫，歸脾、胃、腎經。有溫中止痛、殺蟲止癢之功效，用于脘腹冷痛，嘔吐泄瀉，蟲積腹痛，蛔蟲癥，外治濕疹瘙癢［1］。我國花椒主產于四川、陜西、河北、江蘇及廣東等地。花椒產地不同、提取方式不同，其揮發油組分各有不同［2］。花椒揮發油具有特殊的辛辣香味，經精制加工后，可作為調制熏衣草型香精的原料，還可藥用［3］。目前花椒揮發油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、油樹脂提取法等［4］，其中又以水蒸氣提取法的應用最多，采用水蒸氣進行提取有提取設備簡單、操作簡單、經濟易行、品質好、對溶劑純度要求不高等優點，較為適用于大生產。參閱有關水蒸氣提取花椒揮發油的文獻，尚未見有多指標優選水蒸氣提取花椒揮發油工藝的報道。本文采用均勻設計多指標試驗篩選了浸泡時間、加熱提取時間、提取溶劑量以及藥材粒度對廣東產花椒中揮發油的提取率及化學成分的影響，并優選出最佳工藝條件，為生產和科研提供依據。

1 材料與儀器

1.1 材料 花椒藥材，購自廣州清平藥材市場，產地:廣東，經廣東藥學院中藥鑒定教研室李書淵教授鑒定為蕓香科植物花椒(Zanthoxylum bungeanum maxin)的干燥成熟果實;無水乙醚、無水硫酸鈉，均為分析純;水為自制超純水。

1.2 儀器 HP5890GC/HP5972MS氣/質聯用儀(美國安捷倫公司)，1μL微量進樣器(上海安亭科學儀器廠)，AY120型電子分析天平(上海島津商貿有限公司)，TC-15型恒溫電熱套(海寧市華星儀器廠)。

2 方法與結果

2.1 試驗方法 將花椒藥材粉碎，過篩，精密稱取30 g，置于500 mL燒瓶中，加一定量水與數粒玻璃珠，振搖混合后，連接揮發油測定器與回流冷凝管，進行揮發油提取，收集揮發油，所得揮發油用無水硫酸鈉干燥，過濾并計算揮發油的含量(%)。各次試驗中該條件保持不變，按照均勻設計安排進行試驗，以提取物得率及化合物為評價指標，考察各因素水平對揮發油提取效果的影響，得出最佳工藝條件。

2.2 均勻試驗設計 通過預試驗，發現對揮發油提取物得率影響最大的因素有提取時間、浸泡時間、溶劑量、粉碎度。本試驗選用均勻試驗設計表(94)表進行最佳提取工藝的篩選。因素水平見表1，試驗安排及結果見表2。

表1 均勻設計試驗因素水平表

表2 均勻設計試驗安排及結果表

2.3 提取率為指標的結果與數據處理 將表2得到的結果利用均勻設計數據處理軟件(DPS 9.50標準版)進行均勻設計回歸分析，回歸數學模型為:Y=0.010 692+0.003 667X1－0.000 626X2+0.001 974X3－0.000 091X4;顯著水平 p=0.271 8;F=1.918 2;相關系數R=0.810 755;決定系數R2=0.657 3;剩余標準差SSE=0.007 765;調整后的相關系數Ra=0.560 935。根據回歸方程，求出最佳組合見表3。

表3 均勻設計試驗提取率最佳組合

回歸系數t檢驗的結果見表4。被引入的有4個回歸項，即 X1、X2、X3、X4，其中 X1和 X2差異顯著，說明提取時間和浸泡時間對花椒揮發油提取率影響較大。

表4 各回歸項回歸系數的t檢驗結果

由回歸方程因素的系數可見提取時間和加水量對花椒揮發油成分的提取率的影響為正效應。由最優方案可知:提取時間和水量為最大值(X1=5.159 5 min，X3=12.576 0倍)，藥材目數取中等水平(X4=26.961 8目)，浸泡時間取最小值(X2=20.899 4 min)，說明在加大加水量，盡可能加長提取時間可使花椒揮發油提取率升高。

2.4 花椒揮發油的GC-MS分析

2.4.1 氣相色譜條件 色譜柱:Cpsil 5CB(Varian)30 m×0.25 nm×0.25 mm(100%苯甲基硅氧烷);柱溫:80℃;程序升溫:起始溫度80℃保持5 min，以1℃/min升溫至130℃，以2℃/min升溫至200℃，保持5 min;載氣:He氣;載氣流量:1.0 mL/min;進樣方式:不分流進樣;進樣量:1μL(無水乙醚溶液);進樣口溫度:280℃。

2.4.2 質譜條件 離子源為EI源;電離電壓:70 ev;電子倍培電壓:1 976 mV;質譜Temp=169℃;Vacuum:64 mTorr;溶劑延時:5 min;質譜掃描范圍:50～550 aum;掃描質量范圍:50～550 m/z;樣品經峰純度檢測，Wiley 138譜庫檢索。

2.4.3 揮發油成分分析 按上述的色譜-質譜條件對花椒揮發油進行分析，獲得總離子流圖。經分析確定的37種化合物及其相對百分含量如表5所示。由表5可知，用無水乙醚溶解的揮發油樣品通過氣相色譜儀，隨著程序設置的溫度逐漸升高，使得化合物按沸點由低至高依次氣化，順次進入質譜檢測儀中裂解，獲得各單體化合物的質譜圖。共分離出43個峰，通過Wiley質譜數據庫檢索，并參照標準譜圖進行對照鑒定，鑒定37個成分，主要成分為桉葉油醇、芳樟醇、(－ )-4-萜品醇、α-萜品醇。

2.4.4 揮發油化學成分為指標的均勻分析 由于消費者對產品的要求越來越多樣化，所以在均勻設計試驗中，需要考察的指標不止一個，而是在2個或2個以上。這種試驗稱為“多指標試驗”。本次試驗采用的是均勻試驗，對試驗結果數據的分析從各方面考慮，綜合決定因素主次及最優水平組合。常用的對多指標試驗結果數據的分析有“綜合評分法”，是一種將多指標按著一定的規則轉換為單指標的方法。本試驗利用一個包含有各項指標加權系數(權值)的公式計算每號試驗結果的綜合評分。加權系數的大小體現了各項指標的重要程度。這種方法對指標乘以相應的加權系數得該項指標的加權評分，再把每號試驗的所有指標的加權評分相加即得綜合評分。

表5 花椒揮發油化學成分的相對百分含量/%

多指標綜合評價中評價指標與權重系數確定將直接影響綜合評價的結果。在本試驗中綜合考慮了藥效與化學成分含量高低，并結合文獻將本次實驗分離鑒定出的花椒揮發油化學成分中揮發油主要有效成分并峰面積較大的成分有桉葉油醇、芳樟醇、(－)-4-萜品醇、α-松油醇和 β-欖香烯，故給予12%的加權系數，另外將次要主分及含量相對較低的乙酸芳樟酯、乙酸冰片酯、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯等，給予2%的加權系數，其余均給予1%的加權系數，其花椒油中各化合物峰面積及加權系數見表6，所得綜合評分結果見表7。

將表7得到的結果利用均勻設計數據處理軟件(DPS9.50標準版)進行均勻設計回歸分析，得到回歸方程:Y=1 128 560 420.75－294 232 738.13X1+35 356 118.93X2－9 558 106.77X3－6 936 878.76X4;顯著水平p=0.089 5;F=4.423 0;相關系數R=0.903 105;決定系數R2=0.82;剩余標準差SSE=439 874 431.94;調整后的相關系數Ra=0.79。根據回歸方程，得到最佳組合見表8。

回歸系數t檢驗的結果見表9。被引入的有4個回歸項，即 X1、X2、X3、X4，其中 X1和 X2差異顯著，說明提取時間和浸泡時間對花椒揮發油化學成分影響較大。

由回歸方程因素的系數可見浸泡時間對花椒揮發油成分的提取率的影響為正效應。由最優方案可

表6 花椒揮發油化學成分的峰面積及加權系數

表7 均勻設計花椒揮發油化學成分綜合評分試驗數據

表8 化學成分為指標均勻設計試驗最佳組合

表9 各回歸項回歸系數的t檢驗結果

知:提取時間、加水量和藥材目數為最小值(X1=1.064 0 min，X3=8.512 0 倍，X4=4.178 4 目)，浸泡時間取最大值(X2=63.793 9 min)，說明加長浸泡時間的話，在縮短提取時間也能提取出較優質的揮發油。

2.4.5 揮發油化學成分直觀分析 我們由9個花椒樣品揮發油特征圖譜及表5發現，在不同的提取條件下，水蒸氣提取花椒揮發油得出的揮發油成分有較大差異。從全部提取工藝中分離鑒定出37化合物，見表10，其中含氧有機化合物18種，占被測成分種類的50%，其中組分中含量最多的是桉葉油醇、芳樟醇、(－)-4-萜品醇、α-萜品醇;而烴類化合物中占組分含量較多的是β-欖香烯，另外，醋酸酯類如酸芳樟酯、乙酸冰片酯、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯等都有較高的含量。

表10 花椒揮發油的各化學成分信息

3 討論

均勻試驗數據用處理軟件DPS 9.50標準版作回歸處理所得，最優條件為對于花椒揮發油提取率來說提取條件是:浸泡時間20 min、加熱提取時間5 h、提取溶劑量12倍以及藥材粒度24目;對于揮發油化學成分來說提取條件為:浸泡時間60 min、加熱提取時間1 h、提取溶劑量8倍以及藥材搗碎。

本試驗提取揮發油的溶劑是水，提取得到的成分以單萜和倍半萜為主，設計了多指標均勻試驗，每個水平試驗得到的揮發油成分存在差異，共同的成分為桉葉油醇、芳樟醇、(-)-4-萜品醇、α-松油醇、香芹酮、3甲基-6-(1-甲基乙基)-2-環己烯-1-酮、乙酸芳樟酯、乙酸冰片酯、1-P-Menthen-8-Ylacetate、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯、β-欖香烯、β-甜沒藥烯等。從沸點角度探討，改變揮發油提取時的溫度條件，可以提高揮發油中倍半萜的提取率，因為倍半萜類是揮發油高沸程(250～280℃)的主要成分。通過改變提取條件，可以提取出不同的揮發油成分。

本次實驗選用的是廣東產的花椒，主要化學成分為桉葉油醇、芳樟醇、(－)-4-萜品醇、α-萜品醇、香芹酮等，上述檢出物質種類、含量等方面與其他文獻的報道有所差別，文獻中報道［5］蜆殼花椒中含量較高的生物堿類化合物未被檢出;而在本工作中被檢出含量較高的醋酸酯類化合物，在岳陽花椒中未曾有報道檢測出的情況［6］。由此可見花椒揮發油化學成分間的差異與花椒的產地和品種有著密切的聯系。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:110.

［2］李建紅，張水華，孔令會.花椒研究進展［J］.中國調味品，2009，34(2):28-35.

［3］季永芹，劉崇慧.花椒的藥用價值［J］.中國民間療法，2003，11(7):46-47.

［4］路純明，張小麟.花椒揮發油提取方法及組分分析［J］.中國糧油學報，1996，11(4):12-16.

［5］湯 俊，朱 衛，屠治本.蜆殼花椒化學成分的研究［J］.中草藥，1995，26(11):563-565.

［6］閻建輝，唐課文，許 友，等.GC/MS法分析花椒揮發油的化學成分［J］. 質譜學報，2003，24(2):326-330.