蟾烏巴布膏的質量標準研究

周慶氫， 張 聰， 謝 松

(1.上海雷允上藥業有限公司，200002;2.上海市中藥研究所，201401)

蟾烏巴布膏是劉嘉湘教授的臨床驗方，由蟾蜍、川烏、重樓等24味名貴藥材組成，應用現代制劑技術，采用親水性高分子輔料制備的巴布膏。蟾烏巴布膏對腫瘤以及其他疼痛均有良好的療效，更有活血化瘀，消腫止痛之功效，被臨床廣泛認可，是國內唯一腫瘤中藥外用藥。為控制該制劑質量，采用色譜法對其中的蟾酥、生川烏、生關白附、兩面針、蓽茇、細辛、乳香、沒藥、丁香、肉桂等藥材進行了鑒別，并采用氣相譜法對蟾烏巴布膏中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯等多個有效成分的含量進行了測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HP-6890 plus氣相色譜儀(美國HP公司)，氫火焰檢測器，HS3120型超聲波提取儀(淮陰漢邦科技有限公司)，梅特勒托利多AE240電子天平(十萬分之一)。

1.2 試藥 丁香酚、桂皮醛、胡椒堿、樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對照品，兩面針、蓽茇、細辛、乳香、沒藥對照藥材均購自中國藥品生物制品檢定所，石油醚(60～90℃)為分析純(杭州煉油廠)，其余試劑均為分析純(中國醫藥集團上海化學試劑公司)，硅膠G、硅膠H、硅膠GF254薄層預制板(青島海洋化工廠)。

1.3 樣品 蟾烏巴布膏(上海雷允上藥業有限公司)，批號:071001，071101，071201。

2 方法與結果

2.1 色譜鑒別

2.1.1 蟾酥的薄層鑒別［1］取蟾烏巴布膏1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加氯仿50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為供試品溶液。

另取脂蟾毒配基及華蟾酥毒基對照品，加氯仿制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VI B)試驗［2］，吸取供試品溶液及對照品溶液各5 μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-氯仿-丙酮(4∶3∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點(見圖1)。

圖1 蟾酥薄層鑒別色譜圖

2.1.2 生川烏、生關白附的薄層鑒別［3］取蟾烏巴布膏1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加濃氨試液0.5 mL，氯仿50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

取生川烏、生關白附對照藥材1 g，加濃氨試液0.5 mL，氯仿 50 mL，加熱回流 1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。

另取烏頭堿對照品，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VI B)試驗，吸取供試品溶液15μL，及對照藥材、對照品溶液各10μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-二乙胺(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀，供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.3 兩面針的薄層鑒別［4］取蟾烏巴布膏1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加濃氨試液0.5 mL，氯仿50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為供試品溶液。

另取兩面針對照藥材1 g，加濃氨試液0.5 mL，氯仿30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。

照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VI B)試驗，吸取供試品溶液5μL，對照藥材溶液3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(20∶5∶3∶1∶0.12)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.1.4 蓽茇的薄層鑒別［5］取蟾烏巴布膏1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加濃氨試液0.5 mL，氯仿50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為供試品溶液。

取蓽茇對照藥材0.5 g，加濃氨試液0.5 mL，氯仿30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。再取胡椒堿對照品，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部 附錄VI B)試驗，吸取供試品溶液10μL，對照藥材1μL和對照品溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-丙酮(7∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇(v/v)溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點(見圖2)。

圖2 蓽茇的薄層鑒別色譜圖

2.1.5 細辛的薄層鑒別［6］取本品1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加乙酸乙酯50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。

另取細辛對照藥材1 g，加乙酸乙酯30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。

照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VI B)試驗，吸取供試品溶液10μL和對照藥材溶液3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(85∶15)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。(見圖3)

圖3 細辛的薄層鑒別色譜圖

2.1.6 乳香、沒藥的薄層鑒別［7］取本品1片，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，加乙酸乙酯50 mL，加熱回流1 h，取上清液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。

取乳香、沒藥對照藥材各0.5 g，各加乙酸乙酯30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣分別加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。

照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VI B)試驗，取供試液溶液10μL，對照藥材溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯(85∶15)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。(見圖4)

圖4 乳香、沒藥的薄層鑒別色譜圖

2.1.7 丁香、肉桂的鑒別 取本品2片，剪成小塊，除去蓋襯，置250 mL回流瓶中，加乙酸乙酯100 mL，水浴上回流1 h，迅速冷卻，用鋪有無水硫酸鈉的漏斗濾過，濾液減壓回收至干，殘渣用乙酸乙酯溶解并轉移至2 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，離心，取上清液，作為供試品溶液。

另取丁香酚和桂皮醛對照品，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含丁香酚0.15 mg、桂皮醛0.015 mg的溶液，作為對照品溶液。照氣相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VI E)試驗，用彈性石英毛細管柱，以聚乙二醇PEG-20M為固定相，柱溫為180℃。分別吸取供試品溶液和對照品溶液各1μL，注入氣相色譜儀。供試品溶液色譜圖中應呈現與對照品保留時間相同的色譜峰。

2.2 樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量測定［8］

2.2.1 試液的配制 內標溶液的制備:取萘適量，精密稱定，加無水乙醇溶解，制成每1 mL含1.2 mg的溶液，即得。

混合標準品的制備:取樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯對照品適量，分別精密稱定，分別加無水乙醇制成每1 mL含1、2、1、1 mg的溶液。分別精密量取上述4種對照品溶液1 mL，置同一20 mL量瓶中，精密加入上述內標溶液1 mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備:取蟾烏巴布膏5片，每片分別精密截取6 cm2，共30 cm2，剪成小塊，除去蓋襯，置150 mL回流瓶中，精密加入無水乙醇50 mL，稱定重量，置水浴上回流2 h，迅速用冰浴冷卻，用無水乙醇補足減失的重量，濾過，精密量取續濾液10 mL，置20 mL量瓶中，精密加入內標溶液1 mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 色譜條件及系統適應性試驗 J＆W INNOWAY彈性石英毛細管柱(固定相為聚乙二醇PEG-20 m，30 m ×0.53 mm，固定相厚度 1 μm)，程序升溫，柱溫140℃保持23 min，以每分鐘6℃升溫至200℃保持20 min，進樣溫度280℃;檢測器溫度300℃，分流進樣，分流比1∶1，理論板數以薄荷腦計算不低于20 000。

分別取樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯空白樣品進行平行試驗，空白樣品均無干擾，且供試品在內標物保留時間處無干擾。見圖5～7。

圖5 供試品中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量測定氣相色譜圖

圖6 基質空白溶液氣相色譜圖

圖7 樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對照品溶液氣相色譜圖

2.2.3 線性關系試驗 精密吸取混合對照品貯備液按一定稀釋比例，配制成不同濃度的混合對照品溶液，分別吸取1μL注入氣相色譜儀，測得各組份及內標物的峰面積，并計算回歸方程，結果見表1。

表1 樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯等線性關系考察

表明:在線性范圍內樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯線性關系良好。

2.2.4 日間精密度 取線性關系試驗中取同一供試品溶液在不同日分別進樣5次，每次1μL，在以下時間點:0、1、2、3、5 d 時測定色譜峰吸收值，結果樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的 RSD分別為0.88% 、1.65% 、1.42% 、1.11% 。

2.2.5 日內精密度 取線性關系試驗中同一供試品溶液在當日分別進樣5次，每次1μL，在以下時間點:0、1、2、4、10 h 時測定色譜峰吸收值，結果樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的 RSD分別為0.32% 、1.00% 、0.29% 、1.49% 。

2.2.6 重復性試驗 取蟾烏巴布膏(批號:071001)，分取5份，分別按2.2.1項及2.2.2項下的方法制備供試品溶液，進樣測定，結果見表2。

表2 日重復性試驗(n=5)

2.2.7 回收率試驗 取蟾烏巴布膏(批號:071101)，分取6份，加入一定量對照品，按2.2.1項及2.2.2項下的方法制備供試品溶液，進樣測定，結果見表3。

表3 回收率實驗結果(n=6)

2.2.8 樣品測定 分別精密吸取3批樣品(071001、071101、071201)的供試品溶液，與混合對照品溶液1μL注入氣相色譜儀，進樣測定含量，結果見表4。

3 討論

3.1 蟾烏巴布膏是采用親水性高分子輔料制備的巴布膏，為保證產品質量我們對該產品中的多味藥材進行了定性的研究，采用薄層色譜法對其中的蟾酥、生川烏、生關白附、兩面針、蓽茇、細辛、乳香、沒藥、丁香、肉桂等藥材進行了鑒別，建立蟾烏巴布膏中蟾酥、兩面針、蓽茇、細辛、乳香、沒藥、丁香、肉桂的定性方法，其中生川烏和生關白附的鑒別，因為存在干擾，故需要進一步研究。

表4 樣品的含量測定

3.2 本試驗比較了以不同溶劑(甲醇、無水乙醇)、不同提取方法(超聲、回流、索氏提取)和不同超聲時間(15、30、45、60 min)對樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯提取效果的影響。結果以無水乙醇回流提取的效率最高，回流時間2 h，已可將樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯提取完全，故選用無水乙醇回流提取2 h作為提取條件。

3.3 通過實驗，制定了蟾烏巴布膏中蟾酥、兩面針、蓽茇、細辛、乳香、沒藥、丁香、肉桂等八味藥材的色譜鑒別方法，并用氣相色譜法測定了產品中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的含量。方法簡便、專屬性強、重現性好，可有效的控制蟾烏巴布膏的質量。

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