HPLC-DAD同時(shí)測定通達(dá)顆粒中4種活性成分的含量

宋永貴， 蘇 丹， 耿璐璐， 孫立新*

(1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016;2.遼寧省撫順市藥品檢驗(yàn)所，遼寧撫順113006)

通達(dá)顆粒是在中醫(yī)臨床驗(yàn)方和現(xiàn)代藥理學(xué)研究基礎(chǔ)上，由白芍、紅花、黃芩、川芎、天麻、莪術(shù)、蒲公英等藥組成，具有活血祛瘀、行氣止痛、清熱利濕的功效［1-4］。主要用于輸卵管黏連、堵塞導(dǎo)致的不孕不育癥。其中，君藥紅花、白芍，養(yǎng)血和血、逐瘀消癥;臣藥川芎、黃芩行氣止痛、清熱解毒。為了多指標(biāo)嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，以方中君藥紅花、白芍的主要有效成分羥基紅花黃色素A和芍藥苷，臣藥黃芩、川芎的主要成分黃芩苷和阿魏酸作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)成分。目前關(guān)于黃芩苷、芍藥苷和阿魏酸的含量測定方法報(bào)道較多［5-7］，但同時(shí)測定上述4種成分的方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)根據(jù)4種成分不同的紫外吸收特征，利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器連用儀器在線監(jiān)測多個(gè)波長的優(yōu)勢，在不同紫外檢測波長下，對上述4種活性成分同時(shí)測定含量。該方法分離效果好、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為通達(dá)顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-10AT型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，SCL-10A型 DAD檢測器(日本 Shimadzu公司)，AB135-S天平(瑞士 Metrler toledo公司)。水為重蒸水，除甲醇、磷酸為色譜純外，其他所用試劑均為分析純。供含量測定用芍藥苷對照品(批號:110736-200423)、羥基紅花黃色素A對照品(批號:111637-200301)、阿魏酸對照品(批號:0773-9910)和黃芩苷對照品(110715-200514)均購自中國藥品生物制品檢定所，通達(dá)顆粒(自制，批號為20080316，20080318，20080320)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，取約1.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，搖勻，稱重，超聲20 min使溶解，放冷，稱重，用70%甲醇水補(bǔ)足損失的重量，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取在60℃減壓干燥2 h的各對照品適量，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷的濃度分別為0.104、0.512、0.154 4、0.65 mg/mL。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別制備不含白芍、紅花、川芎、蒲公英或黃芩的制劑陰性樣品按2.1.1項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱為Alltech Apollo C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脫［75%B→65%B(0～10 min)，65%B→63%B(10～20 min)，63%B→48%B(20～35 min)，48%B→43%B(35～45 min)］;流速為1.0 mL/min;檢測波長為230 nm(羥基紅花黃色素A，芍藥苷)，315 nm(阿魏酸，黃芩苷);柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μL。在上述色譜條件下，羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，得到對照品、樣品及陰性色譜圖見圖1～6。

圖1 對照品HPLC色譜圖

圖2 樣品HPLC色譜圖

圖3 缺紅花陰性對照樣品HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

圖5 缺川芎、蒲公英陰性對照樣品HPLC色譜圖

圖6 缺黃芩陰性對照樣品HPLC色譜圖

精密量取各對照品溶液 0.5、1、2、4、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。取上述混合溶液各20μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析。用峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明羥基紅花黃色素A芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷的回歸方程分別為:Y=2.303×105X+5.418×104(r=0.999 1)、Y=1.289×105X+1.620×104(r=0.999 6)、Y=2.604×104X+1.288×103(r=0.999 5)、Y=1.044 ×104X+1.499 ×103(r=0.999 5)。羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷的線性范圍分別為 5.20～104 mg/L，25.6～512 mg/L，7.72～154.4 mg/L和32.5～650 mg/L。

2.4 精密度試驗(yàn)

取芍藥苷、羥基紅花黃色素A、阿魏酸和黃芩苷的混合對照品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷峰面積的 RSD分別為1.9%、2.7%、2.0%和1.5%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號樣品(20080316)6份，按2.1.1項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測定，計(jì)算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷含量的RSD分別為1.5%、1.5%、2.1%和1.2%。

2.6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的通達(dá)顆粒((20080316)適量，研細(xì)，取約0.6 g共9份，精密稱重，3份為1組，每3組按低、中、高濃度分別精密加入羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷對照品溶液，依2.1.1項(xiàng)下方法操作。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.7 溶液穩(wěn)定性考察

取供試品溶液，室溫下放置，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h測定，結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.6%、1.9%、1.6%和1.5%。

2.8 樣品的測定

取3批通達(dá)顆粒，每批取3份，依2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法二點(diǎn)法計(jì)算樣品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的確定

3.1.1 梯度條件的確定 為了使所檢測的色譜峰分離度好，出峰時(shí)間合理，采用梯度洗脫方法。羥基紅花黃色素A極性較大，適合在水比例較大的系統(tǒng)中分離，而黃芩苷極性相對較小，適宜在乙腈比例較大的系統(tǒng)中分離，4種成分同步檢測時(shí)，調(diào)節(jié)梯度比例，由水相向乙腈相增大。在此調(diào)整過程中，曾嘗試將乙腈增大，黃芩苷出峰時(shí)間提前，但梯度變化太快，基線不平穩(wěn)，有較大坡度，故最終確定35 min到45 min范圍內(nèi)，水相比例由48%到43%，梯度平緩，基線平穩(wěn)。保證了4種成分同時(shí)測定的情況下，節(jié)省分析時(shí)間。

3.1.2 流動相系統(tǒng)的確定 本研究曾分別采用了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸酸水溶液、甲醇-0.2%醋酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液等流動相體系。結(jié)果相比于甲醇，使用乙腈所得到的色譜峰，峰形更加尖銳，理論塔板數(shù)更高。由于阿魏酸含有酚羥基，具有酸性，采用了反相離子抑制色譜，在流動相中添加少量酸，抑制其解離，解決了其色譜峰拖尾和展寬的問題。較醋酸水系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)條件下的磷酸水系統(tǒng)，分離效果更好，基線更平穩(wěn)，樣品色譜中4個(gè)成分的峰形好，與雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5。最終確定乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)為流動相。

3.1.3 檢測波長的確定 由于4個(gè)成分光譜差異大，采用二極管陣列檢測器對4種成分同時(shí)測定。在選擇檢測波長的過程中，為了使定量過程盡量簡便，且考慮到在芍藥苷最大吸收波長230 nm處，羥基紅花黃色素A吸收強(qiáng)度大，分離效果較理想，將這2個(gè)成分的檢測波長定為230 nm。阿魏酸最大吸收波長315 nm，黃芩苷最大吸收波長330 nm，考慮到通達(dá)顆粒中黃芩苷含量較大，阿魏酸含量較小，故將這2個(gè)成分的檢測波長定為315 nm。

3.2 供試品與陰性樣品制備方法的考察

本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取方法并考察了溶媒(水、甲醇、70% 甲醇)和超聲時(shí)間(10 min，20 min，30 min)對提取效率的影響。結(jié)果顯示，水為溶媒，提取的供試品雜質(zhì)干擾多，羥基紅花黃色素A與雜質(zhì)峰不能達(dá)到基線分離。而以70%甲醇為溶媒，超聲20 min已可將樣品中芍藥苷、羥基紅花黃色素A、阿魏酸和黃芩苷提取完全，雜質(zhì)峰不干擾測定。羥基紅花黃色素A、芍藥苷和黃芩苷分別為通達(dá)顆粒處方中紅花、白芍和黃芩的指標(biāo)性成分，而阿魏酸是川芎和蒲公英均含有的有效成分，故在阿魏酸陰性樣品的制備中采用了同時(shí)缺川芎和蒲公英藥材的制劑陰性樣品。

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