銀耳菌種規范化生產工藝講座 (三)
——銀耳兩個純菌種的單獨分離與混合育成母種的技術

丁湖廣

(福建省古田縣新元食用菌研究所,古田 352200)

銀耳菌種規范化生產工藝講座 (三)
——銀耳兩個純菌種的單獨分離與混合育成母種的技術

丁湖廣

(福建省古田縣新元食用菌研究所,古田 352200)

銀耳純白菌絲;香灰菌絲;分離;育種;交合

1 銀耳純菌絲分離操作技術

單獨分離銀耳純菌絲和香灰菌絲,然后進行交合培養的母種,具有適應性好、抗逆力強、朵形美、產量高而穩的優點。可以利用兩種菌絲的不同耐旱力,制定銀耳純菌絲分離方法:將新鮮銀耳分離材料的基質,通過干燥器逼干,使不耐旱的香灰菌絲先行枯死,進而分離獲得耐旱存活的銀耳純菌絲 (圖1)。

1.1 菌材選擇 在室內外袋栽或瓶栽銀耳群體中,挑選長勢好、朵形圓正、色白、耳片粗花、肥厚的銀耳。認真觀察耳基周圍是否污染霉菌或放線菌等,袋內顏色是否均勻,若發現污染雜菌或出現雜斑的一律去除。一般以出耳后10～13天健壯期的為好。將挑選好的種耳袋 (瓶)經表面消毒后,把子實體齊耳基切除;挖出耳基正下方及周圍較硬的基質塊,再將基質塊切成半個火柴盒大小的方塊,作為分離材料。

1.2 強行逼干 把基質塊周圍的木屑培養基刮除,將露出白色菌絲體的基質塊用衛生紙或紗布包好,置于 “玻璃干燥器”中,干燥器底層置于濃硫酸、五氧化二磷或變色硅膠,以達到脫水逼干效果。10～15天,香灰菌絲即枯死。也可將基質塊用紗布包好,掛在通風處,經25天左右自然風干后,即可進行分離。

1.3 定位分離 經過干燥的菌材,從不同部位分離的菌絲,其種質有別:取淺層菌絲分離的菌種,菌絲容易發黃,并在試管內很快展開耳片,菌株生活力較弱,朵型小,易爛耳;若取深層菌絲分離的菌種,其生理成熟度低,也影響成活率。為了得到生活力旺盛,并適合培養料栽培的菌株,必須取中層以下至深層部位的進行分離。該部位分離所得的銀耳菌種,成熟度適中,產量穩定。操作時將經脫水后的基質塊,置于接種箱內,剝開菌絲,在基質塊內層,自上而下或從左至右,用接種針挑取具白色菌絲的木屑小顆粒,移接在瓊脂培養基上,一次可接20～30支試管。

圖1 銀耳純菌絲的分離過程

1.4 控溫培養 接種后的試管,置于22～24℃下,經8～10天的培養,銀耳純白菌絲可以恢復生長。當純白菌絲出現后,用接種針挑取少許移接到瓊脂培養基上培養。若分離培養后還出現香灰菌絲,可繼續將分離材料干燥,使香灰菌絲全部死亡后再分離。若培養基偏濕或表面存在水滴,培養后則易出現以酵母狀分生孢子方式增殖的現象,或同時出現銀耳純菌絲與酵母狀分生孢子。銀耳純菌絲生長十分緩慢,在適溫下培養20天左右,其菌落只有豆粒大小。

1.5 提純擴大 上述第一次分離出來的銀耳純菌絲,待菌落長到黃豆大小時,應進行純化擴大培養。方法是用接種針在銀耳菌落邊緣,挑取小米粒大小帶培養基的銀耳純菌絲,移接到試管培養基斜面上,每管斜面接2～3個點,然后置于23～25℃下培養10天左右。當接種點周圍出現白色短密的菌絲,形似繡球狀的白毛團,而培養基不變色,此即為銀耳純菌種。

2 香灰菌絲分離操作技術

獲得銀耳純菌絲后,還得分離作為 “開路先鋒”的伴生菌香灰菌絲,其來源與分離技術如下。

2.1 從種木中分離 在野生銀耳生長的木材中或栽培銀耳的段木中,都存在抗逆性及分解基質能力較強的香灰菌絲,經過馴化培養,其性狀都十分優良。袋栽銀耳的培養基內的香灰菌絲,常因反復移植使用,生命力不如前者旺盛。分離香灰菌絲時,應選取子實體潔白、朵大、開瓣清楚、無病蟲害、無爛頭和無雜菌的種木,在靠近子實體基部,截取一段作為分離材料。在接種箱內割掉子實體,并熏蒸滅菌,然后從木材斷面褐色花紋較密處,切下一小塊木材,用0.1%升汞溶液進行表面消毒后,置于培養皿內。再用經火焰滅菌后的解剖刀,削去木材外層,用刀尖將木材切成粗細如同火柴梗,長0.5厘米的小段。取一小段接入瓊脂培養基的斜面上,移接后的試管置于24～28℃下,培養5～6天菌絲萌發。隨著培養時間的延長,菌絲產生色素溶入培養基中,使之變成黑色。當菌絲長至斜面1/2時,挑取菌落前端的菌絲,轉管純化培養4～5天,便可得到純香灰菌絲體。

2.2 從木屑培養基中分離 在接種箱無菌條件下,打破 (剪開)銀耳菌種瓶 (袋)底部,從大理石狀黑色花紋上選取香灰菌絲生長的前端,挑取米粒大小,移接到瓊脂培養基斜面上,培養2～3天后斜面上的接種點出現灰白色菌絲,繼續培養1～2天,產生絨毛狀氣生菌絲,并能分泌黑色素使培養基逐漸變為棕黑色。當菌絲長至斜面1/2時,挑取生長旺盛、爬壁力強的香灰菌絲的前端,轉管純化。香灰菌絲生長較快,在24～28℃下培養4～5天,便可獲得純香灰菌絲。

3 兩種菌絲的特征與交合育成母種的方法

銀耳純菌絲和香灰菌絲單獨分離時,由于分離技術不同,分離效果也不一樣。大致可以得到下列幾種結果:只得到銀耳純菌絲;只得到羽毛狀香灰菌絲;得到銀耳純菌絲和香灰菌絲;得到酵母狀分生孢子和香灰菌絲。如果有雜菌干擾,情況就更復雜了。為了得到有生產價值的菌種,在分離的第一周內,必須每天觀察一次,判斷認定銀耳純菌絲或香灰菌絲各已單獨分離出來,然后用于交合母種。

3.1 兩種菌絲的辨別

(1)銀耳純菌絲的特征。白色、淡黃色,以及白至黃的各種中間色。氣生菌絲直立、斜立或平貼于培養基表層,基內菌絲生于培養基里面。菌絲直徑1.5～3微米,有橫隔膜,有明顯的鎖狀連合,生長速度比一般食用菌緩慢。在培養基表面會出現扭結的菌絲團,并逐漸膠質化,變成小原基,長成小耳片。當雙核菌絲開始膠質化,是菌絲進入結實階段的標志。雙核菌絲移植后,受菌齡、發育程度、培養基表面的游離水和機械刺激等的影響,或繼續長菌絲,或迅速膠質化,或變成酵母狀分生孢子。

(2)香灰菌絲的特征。初期白色,常有特別細長的主干和側生的、略呈羽毛狀的分枝,老菌逐漸變成淺黃、淺棕色,培養基逐漸由淡褐色變為黑色或墨綠色。培養基表面的氣生菌絲呈灰白色、細絨狀,有時有碳質的黑疤。分生孢子梗呈掃帚狀,較少見,產生時為黃綠色至草綠色,近橢圓形,直徑3～5微米,在段木表面還可形成扁平黑色的子座。已知羽毛狀香灰菌絲絕不單是1個種,可能有2個屬3～4個種。

3.2 兩種菌絲交合育成母種的方法 經純種分離法而得到單一的銀耳純菌絲或香灰菌絲,如果單獨接種在棉籽殼或木屑等培養基上培養,是無法形成銀耳子實體的。在生產上必須將兩者混合培養才能形成高產優質的銀耳子實體。因此,人工培育的銀耳菌種,必須是銀耳純菌絲與香灰菌絲的混合體。兩種菌絲交合培養成母種,一般需要30天左右。具體交合的方法有兩種。

(1)在瓊脂培養基上交合。用芽孢進行混合培養的,應先接種少許芽孢,待其萌發形成銀耳菌絲后,再接種香灰菌絲。如果是用銀耳純菌絲進行混合培養,應將一塊帶瓊脂培養基似米粒大的銀耳純菌絲,移到另1支瓊脂斜面上,置22～24℃下培養5～7天。待銀耳菌落直徑達1厘米以上時,在其旁邊接入一小點帶瓊脂培養基的香灰菌絲,在相同溫度下繼續培養7天左右,出現繡球狀白毛團;10天后在白毛團上方出現無色或淡黃色水珠。香灰菌絲快速生長布滿整個培養基,并分泌黑色素,使瓊脂培養基底部呈黑色。這種混合菌絲體的銀耳母種,1支試管一般只接1瓶原種。

(2)在木屑培養基上交合。先將帶瓊脂培養基的花生米大小的銀耳純菌絲團接入木屑培養基中央;再用接種針挑取香灰菌絲連同培養基,以小米粒大小移接在菌種瓶的木屑培養基上,兩種菌絲塊緊靠一起。然后置于22～24℃,空氣相對濕度70%以下條件下培養15天左右。待香灰菌絲長至培養基3～4厘米深,瓶壁上可見黑色花紋;白毛團分泌淡黃色或淺褐色水珠時,繼續培養5天,白毛團膠質化,出現淡黃色原基,并逐漸長出拇指大小的子實體時,即成木屑培養基母種。

4 銀耳 “非專一性”分離擇優交合的育種方法

長期以來,我國銀耳菌種分離方法強調 “專一性”,即銀耳菌絲和香灰菌絲分離時必須在同一耳木或同一袋木屑培養基上,分別獲得銀耳純菌絲 (包括酵母狀分生孢子)和香灰菌絲進行交合。而不同地區或同一地區,不同耳木或不同木屑培養基獲得的兩種菌絲,不能隨意調換,否則就可能導致失敗。

自1993年開始,古田縣興達銀耳研究所張漢文所長,開展在不同栽培地點、不同菌株、不同木屑培養基內,分離出銀耳菌絲與香灰菌絲,經培養后進行擇優調換,互相錯開交合的育種試驗。結果表明:“非專一性”的擇優交合,從母種、原種、栽培種,直至用于袋栽生產,它與“專一性”對照組相比,菌絲生長狀況與出耳時間、品質及產量都較優。這說明銀耳菌種分離材料,也可以從異地引進野生或段木的香灰菌絲與當地木屑袋栽銀耳純菌絲交合,關鍵在于選取分離材料時擇優母體。優中交合,使菌種不斷優化,才能為銀耳制種拓寬途徑。該所每年都從四川通江等段木栽培地,引進長過銀耳的木段,分離香灰菌絲,再與古田袋栽銀耳純菌絲交合,獲得理想菌株。以此種 “非專一性”交合育種方法,完成了寧德市科技局 《征集野生銀耳種源選育優良菌株研究》項目,選育出抗性強、產量高的2個新菌株,其出耳現場,獲得驗收組專家好評。

“非專一性”的分離交合,長期被視為難題的原因,主要是當時研究銀耳菌種的單位和專業人員不多,發現銀耳兩種菌絲的歷史不長,純菌絲親和能力較弱,適應性不強,稍有不周,分離便告失敗。所以,這種 “非專一性”的問題一直未被解決。隨著銀耳人工馴化栽培方式的演變,由段木→木屑瓶內開花→木屑瓶外展片→室內袋料栽培→野外蔭棚栽培;由小面積發展到千家萬戶專業化、商品化、基地化的大規模栽培。這種演變過程,使銀耳菌絲的適應性不斷增強,“非專一性”交合,在生理上逐步適應,這為 “不同一”擇優交合育種提供了內因條件,這是生物進化的自然規律。但從不同野生耳木或不同產地采集分離獲得的香灰菌絲,接種在同一培養基上,又會出現不親和的拮抗線,說明香灰菌品系之間有特殊個性。對此,還有待進一步探討(圖 2)。

圖2 不同香灰菌絲接種在同一培養基上產生的拮抗線

5 母種轉管擴接方法

一般對分離獲得的一代母種,都要進行擴大繁殖,即選擇菌絲粗壯、生長旺盛、顏色純正、無雜菌的試管母種,或從科研部門引進母種,進行轉管擴大繁殖,增加母種數量,以滿足生產需要。銀耳混合菌絲的試管母種,每支一般只能擴接成2～4支。轉管次數不應過多,否則菌種長期處于營養生理狀態,生命繁衍受到抑制,進而導致菌絲活力下降,營養生長期縮短,子實體變小,變薄,影響產量和品質。因此母種轉管擴接,一般宜為3次。

母種轉管擴接無菌操作技術如下。

5.1 消毒握管 雙手和菌種試管外壁,用75%酒精棉球擦拭;將菌種和斜面培養基的2支試管握在左手中,使中指位于2試管之間,斜面向上,并使其呈水平位置。

5.2 松塞灼口 用右手將棉塞擰轉松動,以利接種時拔出;右手拿接種針,對在接種時可能進入試管的部分,全部用火灼燒過;再用右手小拇指、無名指和手掌拔掉棉塞,夾住。靠手腕的動作不斷轉動試管口,并通過火焰灼燒。

5.3 接種入管 將燒過的接種針伸入試管內,先接觸沒有長菌絲的培養基,使其冷卻;然后將接種針輕輕接觸菌種挑取少許,抽出試管,注意菌種塊不能碰到管壁;隨之將接種針上的菌種,迅速通過酒精燈火焰上方,伸進另一支試管,接入培養基中央。

5.4 回塞管口 菌種接入后,灼燒管口,并在火焰上方將棉塞塞好。塞棉塞時不要用試管去迎棉塞,以免試管在移動時進入不凈空氣。

接種的整個過程應迅速、準確。最后將接好的試管貼上標簽,送進培養箱 (室)培養。