不同DO下MBR內微生物群落結構與運行效果關系

高大文,李昕芯,安 瑞,付 源,任南琪

(哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090)

不同DO下MBR內微生物群落結構與運行效果關系

高大文*,李昕芯,安 瑞,付 源,任南琪

(哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090)

應用A/O-MBR處理實際生活污水,考察了不同溶解氧(DO)條件下,微生物群落結構與其處理效果的對應關系.結果表明,DO濃度在0.2～4.0mg/L對COD去除效果無明顯影響,COD平均去除率均在90%以上.DO濃度變化對NH4+-N去除影響較大,DO濃度下降到0.2mg/L時,NH4+-N平均去除率由99%下降到65%.通過PCR-DGGE分析,較高DO條件下(4.0,2.0mg/L)的總細菌微生物群落多樣性高于較低DO條件(0.5,0.2mg/L),但其群落結構變化與與反應器的處理效果對應關系不明顯;氨氧化菌的群落結構變化較明顯,且在不同的 DO條件下起主要作用的氨氧化菌的菌屬不同,其群落變化與反應器的NH4+-N去除效果相對應,DO為2.0,0.5mg/L時氨氧化菌群落結構比較相似,此時反應系統的脫氮效果也比較好.

膜生物反應器；溶解氧；PCR-DGGE；微生物群落結構；氨氧化菌

Abstract：Microbial community structure and nutrient removal performance under different dissolved oxygen were investigated using Anoxic-oxic submerged membrane bioreactor (A/O-MBR) for municipal wastewater treatment. Results showed that the COD removal was not influenced markedly by the variations in DO between 0.2mg/L and 4.0mg/L, and the COD removal was more than 90% during the whole experiment. However, the ammonia nitrogen removal was more sensitive than COD, and the ammonia nitrogen removal dropped from 99% to 65% when DO decreased to 0.2mg/L. The PCR-DGGE analysis showed that the diversity of total bacterial community was abundant when A/O-MBR was run at high DO (4.0mg/L and 2.0mg/L), and the relationships between the total bacterial community structure and the performance of MBR was not very obvious. On the contrary, the ammonia oxidizing bacterial community composition had a more obvious shift with the variation of DO concentration, and the species of ammonia oxidizing bacteria which play major role were different under different DO conditions, which were corresponded to the removal efficiency. The ammonia oxidizing bacterial community composition were similar under the DO concentration of 2.0mg/L and 0.5mg/L, and the nitrogen renmoval was enhanced.

Key words：membrane bioreactor (MBR)；dissolved oxygen；PCR-DGGE；microbial community structure；ammonia oxidizing bacteria

膜生物反應器(MBR)與傳統工藝相比,具有固液分離效果好、反應器內生物量高、污泥產量低、出水水質好、占地面積小等優點[1],因此在污水的凈化與處理領域應用廣泛.影響 MBR反應器運行效率的因素有很多,如污泥濃度、水力停留時間(HRT)、污泥齡(SRT)、溶解氧(DO)、污泥負荷等[2-3].其中 DO是極其重要的參數,許多研究[4-8]表明,將 DO控制在合適的范圍之內,不僅可以提高整個反應器的效率,而且可以降低能耗.但從實質上看,微生物是生物法污水處理的主體部分,而目前有關MBR中DO的研究大多數只本研究將結合PCR-DGGE技術[9],對不同DO條件下MBR處理效果和微生物群落結構進行研究,分析DO對MBR去除有機物和氨氮效率及其微生物群落結構的影響,探討 MBR運行特性與微生物群落結構間的相互關系,從而為 MBR的設計及應用提供理論及技術依據.

1 材料與方法

1.1 材料

接種污泥取自哈爾濱市文昌污水處理廠.進水為生活污水,其水質COD為203.9～366.0mg/L, NH4+-N為33.24～61.35mg/L,pH值為7.28～7.83.

1.2 反應器裝置和運行條件

本研究采用缺氧/好氧工藝(A/O-MBR),缺氧和好氧反應器的有效體積均為8L.采用日本三菱公司生產的聚乙烯中空纖維膜,膜孔徑為0.4μm,膜通量0.27m3/(m2?d),膜絲面積為0.11m2.裝置如圖1所示.

圖1 反應器裝置示意Fig.1 Diagram of experimental system1.原水箱. 2.蠕動泵, 3.缺氧罐, 4.氣泵, 5.空氣流量計, 6.好氧MBR, 7.膜組件, 8..真空壓力表, 9.時序繼電器

反應器采用連續進水、間歇出水的方式運行,膜出水抽吸時間比為3min/1min.實驗中HRT控制為8h,回流比為 2.5,溫度維持在 20～25℃,SRT為 50 d,反應器初始污泥濃度為 3200mg/L,待污泥濃度穩定在5000mg/L左右時進行排泥.以DO為 4mg/L啟動反應器.反應器分別在 DO為4.0,2.0, 0.5和0.2mg/L下運行.

1.3 指標測定

每天取水樣,對進水和出水水質指標進行分析,檢測項目包括溫度、DO、COD、NH4+-N、NO2

--N和NO3--N,均采用標準分析方法[10].

1.4 反應器微生物群落結構分析

1.4.1 基因組 DNA的提取 采用小量細菌基因組提取試劑盒(上海華舜,W6501).

1.4.2 總細菌的 PCR擴增 采用通用引物BSF338-GC和BSR518擴增,其反應體系與擴增條件參考文獻[11]中的方法.PCR反應的產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.4.3 氨氧化細菌的PCR擴增 第一輪擴增采用氨氧化細菌特異性引物[12]CTO189f和CTO654r及相應的反應程序.以第一輪PCR擴增產物為模板,采用與總細菌擴增相同的引物進行第二輪PCR擴增,PCR擴增條件與總細菌的條件相同.采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測兩輪PCR產物,均得到清晰的目標條帶.

1.4.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 將 PCR樣品5μL和10倍加樣緩沖液混合,采用Bio-rad突變檢測系統,用 8%的聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度為30～60%,在200V的電壓下,60℃電泳4h.結束后,將凝膠進行銀染,獲得DGGE指紋圖譜.

1.4.5 目的條帶的克隆與測序 挑取DGGE圖譜中的目的條帶溶于30μL的ddH2O中,4℃下靜置過夜,以此為模板,以BSF338和BSR518為引物進行PCR擴增,其擴增程序同1.4.2.PCR產物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收,應用上海華舜膠回收試劑盒.回收后產物與 PMD19-T載體連接,進行轉化克隆,最后測序.

1.5 DGGE圖譜及多樣性分析

微生物多樣性指數采用Shannon指數(H)表示,H=-∑PilgPi,其中條帶強度是通過 Quantity One軟件分析后得到的波峰面積表示,即Pi=ni/N,其中,ni為峰面積;N為所有峰的總面積.

同時對得到的DGGE圖譜進行UPGMA聚類分析,根據不同 DO條件下的條帶分布相似度構建系統進化樹.

1.6 序列分析

將測序結果進行處理后提交到GenBank數據庫,采用 BLAST進行目標序列和基因庫中所含序列的相似性分析,得到同源性最近的序列,并應用MEGA軟件建立進化樹.

2 結果與討論

2.1 DO對反應器處理效果的影響

2.1.1 DO對COD去除效果的影響 反應器在DO為4.0,2.0,0.5和0.2mg/L下運行,由于采用生活污水,膜出水COD為11.1～47.7mg/L,在4個DO濃度條件下,COD的平均去除率分別為90.42%、90.82%、91.39%和91.76%(圖2).

圖2 不同DO條件下反應器對COD的去除效果Fig.2 COD removal under different DO concentrationa、b、c、d表示DO濃度分別為4.0,2.0,0.5,0.2mg/L時系統的運行狀態

由此可見,當DO濃度降低時,COD去除效果未發生明顯變化,說明在MBR中DO的變化對COD的去除影響并不顯著.

2.1.2 DO對NH4+-N去除效果的影響 由于進水是生活污水,進水NO3--N和NO2--N含量很低,可忽略不計.在缺氧段, NO2--N和NO3--N積累很少,反應器中的氮素主要為NH4+-N.由圖3可見,在DO為4.0,2.0和0.5mg/L條件下的穩定運行期,NH4+-N去除率>99%;當DO繼續降低時,NH4+-N去除效果出現了較大波動,DO濃度下降到0.2mg/L時,其平均去除率由99%下降到65%.

在DO為4.0mg/L時,缺氧區的NH4+-N在好氧MBR中都轉化為NO3--N;而當DO降低時,缺氧區的NH4+-N濃度比好氧出水的NO3--N濃度高,說明 DO濃度降低使反應系統的反硝化作用增強.DO濃度為4.0,2.0,0.5和0.2mg/L時,總氮的去除率分別為 67.39%、77.00%、80.92%和56.73%,此結果說明DO濃度為2.0,0.5mg/L時反應系統的氮素脫除效果較好.其原因為好氧段DO濃度高(4mg/L)時易造成缺氧段氧化還原電位升高,從而抑制反硝化細菌的反硝化活性,使得總氮去除率降低[13].

比較MBR中有機物和NH4+-N的去除效果可以得出,當DO濃度減少時,有機物仍可得到有效去除,而NH4+-N去除率卻明顯降低.其原因是反應系統內的主要異養菌受DO影響較小[14],因此 DO的變化對 COD的去除效果影響不明顯.而硝化細菌對氧需求較高[15],過低的DO使得硝化細菌受到了抑制,從而使反應器去除 NH4+-N的效率下降.

圖3 不同DO條件下反應器對氮素的去除效果Fig.3 nitrogen removal under different DO concentrationa、b、c、d表示DO濃度分別為4.0,2.0,0.5,0.2mg/L時系統的運行狀態

2.2 DO對反應器內微生物群落結構的影響

2.2.1 不同 DO條件下總細菌群落結構的比較 總細菌的DGGE圖譜如圖4(a)所示,微生物群落結構隨DO濃度的變化有所不同,與原泥相比較,有部分條帶隨 DO變化逐漸消失或減弱,比較明顯的有條帶 3,5,6,7,8,12,18,21,26,29.說明這部分條帶所代表的細菌對反應系統的環境適應性降低,轉變為非優勢種群而不在反應器運行過程的圖譜中顯現出來.在不同條件下,還存在各自獨有的或較其他條件明顯的種屬,如B中的條帶1,23;C中的條帶9,28;D中的條帶31;E中的條帶14,24;還有部分在2個或3個條件下共有的條帶,如條帶2,4,15,16,17,19,22,36等. 但是一些微生物(條帶 10,11,13,20,27,33,35)在反應器運行過程始終存在,且其在總細菌群落結構中處于優勢地位.

圖4 不同DO條件下總細菌和氨氧化細菌DGGE圖譜Fig.4 DGGE profile of total and ammonia-oxidizing bacteria under different DO concentrationA原泥 B: 4.0mg/L C: 2.0mg/L D: 0.5mg/L E: 0.2mg/L

將圖 4(a)中的主要條帶進行克隆測序后,在GenBank中比對,獲得各條帶的同源性信息,并構建其系統發育樹(圖5).其結果表明,MBR中微生物群落的主要優勢種群分布于不同的綱或屬,且進化距離較大.而且實驗中分離到的很多菌種為未鑒定及培養菌種,其所屬的具體種屬和功能還不是很清楚,這也與張斌等[16]的研究結果相符.同時還發現有些在圖譜中處于不同位置的條帶,其序列比對結果相似,進化距離也較近,這些條帶代表的細菌可能屬于相同菌屬,且有相同功能.在MBR中以變形菌門的細菌種類多一些,包括β變形亞綱和δ變形亞綱,且以β變形亞綱為主,在其他研究[16-18]中也出現過類似結果,說明這些菌群對污染物去除起主要作用.條帶19,20,35遺傳距

離較近,都屬于紅環菌科(Rhodocyclaceae),且在4個條件下均存在,在污水處理的生物降解中起主要作用;條帶 9,36均為從毛單胞菌科(Comamonadaceae),在DO為4.0和2.0mg/L下較明顯;條帶 22,33 均為硝化螺旋菌屬(Nitrospira)[19],將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽;條帶14,24在低DO為0.2mg/L時較明顯,文獻中提到其可能與反硝化作用有關[20-21].

圖5 MBR中總細菌系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of total bacteria

2.2.2 不同條件下氨氧化細菌群落結構的比較 硝化作用是廢水處理系統中實現 NH4+-N去除的主要過程.氨氧化細菌在硝化作用中負責將氨氧化為亞硝酸鹽,實現亞硝化作用,是硝化過程中必不可少的步驟[22].但氨氧化細菌的生長速率低,生物量很少,且 Muyzer[23]的研究表明,只有在整個群落細菌數量約 1%或以上的類群能夠通過DGGE檢測到,所以應用 16S通用引物擴增的DGGE條帶并不能很好的反應其群落變化.而應用特異性引物進行Nested PCR DGGE,可更全面的分析氨氧化細菌的群落結構.

如圖4(b)所示,隨著DO不斷降低,氨氧化菌的群落結構也發生了變化,且在不同DO條件下氨氧化菌群落中的優勢菌群不同.將氨氧化細菌的主要條帶進行克隆測序,構建其發育樹見圖6.由圖6可知,MBR中存在幾種不同種屬的氨氧化細菌,除了條帶 4,8,10為未鑒定的菌,反應系統中存在的氨氧化細菌主要為 β-變形亞綱中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira).并且在不同的DO條件下起主要作用的氨氧化菌屬不同,在DO為4.0mg/L條件下主要為Nitrosospira sp.,在 DO為 2.0mg/L和 0.5mg/L時,主要為Nitrosomonas sp.,而在DO為0.2mg/L時其微生物主要為未培養菌屬,明顯亞硝化菌屬的條帶減弱.

圖6 MBR中氨氧化細菌系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of ammonia-oxidizing bacteria

2.3 MBR的微生物群落結構與其處理效果的對應關系

根據總細菌和氨氧化細菌的 DGGE圖譜(圖4),進行 MBR的微生物群落多樣性指數計算和聚類分析.不同條件下的Shannon指數如圖7所示.在DO為4.0mg/L和2.0mg/L下,總細菌微生物群落的多樣性要略高于DO在0.5和0.2mg/L的兩個條件.根據DGGE條帶的同源性進行聚類分析[圖8(a)],將不同條件下的5個樣品分為3個獨立的群,DO濃度在 4.0,2.0mg/L時微生物群落結構比較相似,較低DO條件下(0.5,0.2mg/L)微生物群落結構較相似,但與原泥相比較,其微生物群落結構均發生較大變化.這些結果都說明在較高DO的條件下微生物群落的多樣性比低DO條件下更加豐富.

圖7 不同條件下MBR中微生物群落Shannon指數Fig.7 Shannon index of microbial population under different DO concentrationA: 原泥 B: 4.0mg/L C: 2.0mg/L D: 0.5mg/L E: 0.2mg/L

在總細菌的群落結構分析中,有部分微生物隨DO的降低發生變化,但反應器的COD去除率并未發生明顯變化,這表明微生物的群落結構變化與反應器的處理效果對應關系不明顯,不同DO下的微生物群落結構變化并未影響系統對有機物的去除.分析其原因可能為大多數微生物屬于異養型[24],所以不同DO條件下異養菌均在總細菌群落中占優勢地位,DO的變化對COD去除影響較小.

氨氧化菌的多樣性分析表明原泥中的氨氧化細菌較少,隨著反應器運行,其多樣性增加,說明氨氧化細菌適于在 MBR反應系統中生長.另外,在 4.0mg/L DO下氨氧化細菌的群落表現出更豐富的多樣性.聚類分析的結果圖 8(b)顯示DO為2.0,0.5mg/L時氨氧化細菌的群落結構最相似,說明DO在0.5～2.0mg/L變化時對MBR中的氨氧化細菌的菌群分布影響不大,同時反應器在DO為2.0mg/L和0.5mg/L時系統的NH4+-N和總氮脫除率均較高.

圖8 DGGE圖譜UPGMA聚類分析Fig.8 Cluster analysis of DGGE by UPGMAA:原泥 B: 4.0 mg/L C: 2.0 mg/L D: 0.5mg/L E: 0.2 mg/L

3 結論

3.1 應用A/O-MBR處理實際生活污水,DO濃度在0.2～4.0mg/L變化對COD去除效果影響不大,但是對NH4+-N去除影響較大.當DO下降到0.2mg/L及以下時,NH4+-N平均去除率下降明顯;DO濃度在0.5～2.0mg/L時系統對NH4+-N和總氮的脫除效果均較好.

3.2 DGGE及測序結果表明,在4.0,2.0mg/L DO下,微生物群落的多樣性要高于0.5,0.2mg/L時的多樣性;DO對氨氧化細菌群落變化影響較大,在不同條件下起主要作用的氨氧化菌屬不同,但DO在0.5～2.0mg/L變化時MBR中的氨氧化細菌的菌群分布具有較高相似性.

3.3 反應系統中總細菌的微生物群落結構變化與反應器的處理效果對應關系不明顯,在不同DO下微生物菌群結構發生的變化對有機物去除影響較小;但對氨氧化細菌的微生物群落結構分析顯示,其氨氧化細菌的變化與反應器的NH4+-N去除效果相對應.

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X703.1

A

1000-6923(2010)02-0209-07

2009-06-04

教育部全國優秀博士學位論文專項基金(200544);教育部新世紀優秀人才資助計劃項目(NCET-05-0330);國家自然科學基金資助項目(50638020)

* 責任作者, 教授, gaodw@hit.edu.cn

高大文(1967-),男,黑龍江佳木斯市人,教授,博士,主要從事環境微生物技術和水污染控制研究.發表論文70余篇.