嗜鹽菌群在甲苯降解過程中群落結構的變化解析

蔣 婧,王 慧*,張麗花,毛心慰,閆 海

(1.清華大學環境科學與工程系,環境模擬與污染控制國家重點聯合實驗室,北京 100084；2.北京科技大學應用科學學院,北京 100083)

嗜鹽菌群在甲苯降解過程中群落結構的變化解析

蔣 婧1,王 慧1*,張麗花2,毛心慰1,閆 海2

(1.清華大學環境科學與工程系,環境模擬與污染控制國家重點聯合實驗室,北京 100084；2.北京科技大學應用科學學院,北京 100083)

從勝利油田的高鹽油污土壤中富集到1個高效降解BTEX(苯、甲苯、乙苯、二甲苯)的嗜鹽菌群,分析了菌群在甲苯降解過程中的群落結構變化.結果表明,該菌群在 5%鹽度下可完全降解 200mg/L甲苯.PCR-DGGE圖譜顯示,隨著甲苯的加入,該菌群的優勢種屬由Bacillus sp.和Bacillus aquimaris轉變為Thalassospira xiamenensis、Pseudomonas stutzeri、Virgibacillus sp.和Bacillus sp..這4種微生物在整個降解過程中穩定存在,且在降解完成后24h內沒有衰亡的跡象.另外,該菌群可以降解菲,顯示了降解多種芳香族化合物的能力.

BTEX；嗜鹽菌群；PCR-DGGE；微生物群落結構

Abstract：A halophilic bacterial consortium that could degrade BTEX (benzene, tolunene, ethybenzene, xylene) at the salinity of 5% was enriched from oil-contaminated saline soil. Bacterial community structure dynamics in toluene degradation by the consortium was analyzed. The consortium could degrade 200 mg/L toluene at the salinity of 5%. PCR-DGGE profiles revealed that with toluene addition, the predominant species shifted from Bacillus sp. and Bacillus aquimaris to Thalassospira xiamenensis, Pseudomonas stutzeri, Virgibacillus sp. as well as Bacillus sp., four of which remained stable during the degradation process and the following 24h when toluene was depleted. In addition, the consortium could degrade phenanthrene, illustrating its versatility in utilizing aromatic hydrocarbons.

Key words：BTEX；bacterial halophilic consortium；PCR-DGGE；microbial community structure

BTEX包括苯、甲苯、乙苯和二甲苯,屬于單環芳烴類物質,對人體中樞神經系統有抑制作用[1],并對人體生殖發育產生毒性效應[2-5]. BTEX是石油中芳香族化合物的主要成分,而石油污染常常伴隨著高鹽環境[6-7].我國陸上油田土壤的含鹽量普遍較高,如中原油田、遼河油田和勝利油田的土壤含鹽度分別為 7,9,15g/kg[8].另一方面,在石油開采過程中產生的大量落地原油及含鹽石油廢水(鹽度>3.5% W/V)的排放均導致油污土壤具有高鹽特征,對普通微生物的正常代謝產生嚴重的影響,因而修復效果很不理想[6].

目前,高鹽環境下微生物對污染物的降解已受到廣泛關注.許多嗜鹽細菌或菌群從受污染的環境中被分離或富集,它們在一定鹽度范圍內能降解烷烴、多環芳烴、BTEX、石油、柴油等污染物[7,9-12].由于菌群的結構與其降解功能密切相關,所以研究嗜鹽菌群群落結構在生物降解中的變化對理解鹽環境中生物修復的過程、提高生物修復效率具有重要意義[13-16].本研究利用 PCRDGGE技術解析了1個BTEX降解菌群[17]在甲苯降解過程中的群落結構變化,并測試了該菌群降解底物的多樣性,以期為高鹽環境中生物修復技術提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 SSDMY培養基組分見文獻[18].

鹽度為5%的LB培養基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化鈉50g/L,用NaOH調節pH值至7.4,121℃滅菌20min.

1.1.2 試劑與主要儀器 苯、甲苯、乙苯、二甲苯(北京現代精細化工,>99.5%),菲(Alfa Aesar, >98%).

氣相色譜儀(島津,GC-14B),高效液相色譜儀(島津,10Avp).

1.2 實驗方法

1.2.1 降解實驗 本研究中的菌群參見文獻[17].菌群降解BTEX的實驗:將甘油管冰上解凍,清洗菌體后接種至5%鹽度的LB培養基.30℃、150r/min避光過夜培養,接種 1mL(OD600=0.8)至含 99mL SSDMY(0.01%酵母提取物)的 300mL錐形瓶(帶龍口塞,氣密性好)中,并向瓶中加入污染物[分別為苯、甲苯、苯和甲苯混合物(1:1)、BTEX(苯:甲苯:乙苯:二甲苯＝1:1:1:1),終濃度均為200mg/L],30℃、150r/min、避光馴化3d,接種,培養并檢測甲苯濃度.

菌群降解菲的實驗:10mL SSDMY(添加0.02%的酵母提取物)液體培養基,加入100μL菲-二甲基甲酰胺溶液(100g/mL)使得培養基中菲的終濃度為 100mg/L,接種菌液 250μL,30℃、150r/min、避光振蕩培養,于第6d和第11d進行檢測.均設置滅活菌液作為空白對照.BTEX濃度測定采用頂空氣相色譜法[19].采用島津 GC-14B(Shimadzu)氣相色譜分析儀,分離柱為ΜLBON HR-1(0.25mm× 30m)毛細管柱,檢測器為FID氫火焰離子化檢測器.分析條件為:毛細管柱溫100℃,進樣器溫度150℃,檢測器溫度150℃.測定結果為3個平行的均值.菲的測定方法如下:在培養瓶中加入50mL甲醇,超聲30min,充分萃取培養液及菌體表面的菲,0.45μm 濾膜過濾后,采用HPLC(島津10Avp)測定萃取液中菲濃度,進樣量為20μL[20].HPLC條件:色譜柱為C18反相柱(依利特,Hypersil BDS C18,250mm×4.6mm×5μm),流動相為甲醇:水(80:20),流速 1mL/min,檢測波長254nm,柱溫40℃.測定結果為3個平行的均值.

1.2.2 群落結構分析 細菌總 DNA的提取:分別在接種后的 24,36,48,60,72,96,120,144h收集1.5mL菌液.12000r/min離心,棄上清.采用細菌基因組小量提取試劑盒(博大泰克)提取總 DNA,取5μLDNA溶液1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

細菌 16S rRNA基因片段擴增以細菌總DNA為模板,進行 PCR擴增.采用目標片段為16S rRNA基因 V6區的引物968f(GC夾板)和1401r[21]. PCR反應體系和程序參見文獻[17].

DGGE電泳分析 采用 Bio-Rad公司DcodeTM基因突變檢測系統對PCR反應產物進行變性梯度凝膠電泳分離.采用 16cm×16cm 8%聚丙烯酰胺凝膠,變性劑范圍為 40%～55% (7mol/L尿素和 40%去離子甲酰胺的混合物為100%變性劑).在1×TAE中,60℃,100V條件下電泳 12h,用 SYBR-Gold(1:000)避光染色 40min, ddH2O清洗后,轉移至UVP凝膠成像系統上進行DGGE凝膠圖像采集和分析.

16S rDNA測序及系統發育樹的構建:目的條帶切膠回收后送交北京三博遠志生物技術公司測序.將測序結果提交 NCBI數據庫并登記獲得登錄號.Blast搜索出相似性高的序列,利用Clustal軟件進行多序列比對,通過Mega3.1構建系統發育樹.

2 結果與討論

2.1 菌群對BTEX的降解

該菌群對 BTEX的降解如表 1所示.在SSDMY(添加 0.02%酵母提取物)中,菌群對所列污染物(初始濃度為200mg/L)均能在80h內完全降解.

表1 菌群對BTEX的降解Table 1 Biodegradation of BTEX by the consortium

考察了在SSDMY培養基(添加0.01%酵母提取物)中菌群對甲苯的降解情況,降解曲線如圖1所示.菌群在5d可完全降解200 mg/L甲苯.

圖1 菌群降解甲苯的降解曲線Fig.1 Biodegradation of toluene in SSDMY by the consortium

2.2 菌群群落結構的解析及其在降解甲苯過程中的動態變化

為考察解析菌群在降解甲苯過程中群落結構的變化,分別在接種后的24,36,48,60,72,96,120, 144h收集菌體,并提取DNA進行群落結構分析.對DGGE圖譜中較亮的16條優勢條帶進行回收測序,獲得的序列提交GenBank注冊并獲得登陸號(FJ820238-FJ820253),利用 BLAST將所測得的序列與GenBank中已經登錄的序列進行同源性比對,獲得數據庫中與該16條序列相似度高的序列,通過軟件進行多序列比對并構建系統發育樹,結果見圖2和表2.

圖2 5%鹽度下菌群群落結構在甲苯降解過程的動態變化Fig.2 Dynamics analysis by DGGE of the consortium in SSDMY during toluene degradation

表2 菌群在5%鹽度下降解甲苯的DGGE圖譜對應條帶的序列比對分析Table 2 Sequence analysis of bands retrieved from the 16S rDNA DGGE profile of the consortium in SSDMY during toluene degradation

根據序列比較的結果,除條帶 16外,其他條帶所含的DNA序列與GenBank中已知序列擁有較高的相似度(≥98%),其中條帶12與已知序列相似度達 100%.菌群各條帶所對應的微生物主要集中在Thalassospira、Pseudomonas、Bacillus、Virgibacillus等屬,與條帶2和16相似的細菌種類為不可培養菌株.各個菌株來源于不同的環境,大都具有重要的生態功能.與條帶7和條帶10相似度均達到99%的是Pseudomonas stutzeri.該種的許多菌株具有降解芳烴的能力,如菌株OX1分別以苯、甲苯、二甲苯和二甲苯酚為唯一碳源和能源生長[22];G11菌株在石油濃度為 1% (V/V)～ 2.5% (V/V)時降解率可達69%～59%[23];AN10和 P16分別可以降解萘和菲[24-25].與條帶12相似度達到100%的Virgibacillus sp.XQ-1是Liu等[26]分離得到的可以降解溴氰菊酯的菌株;與條帶14相似度達99%的是間苯二酚降解菌株Bacillus sp. QQDP517;與條帶15相似度達到99%的Bacillus sp. M15-5是苯并[a]芘降解菌群的組分.這些在甲苯降解過程中出現的主要條帶對應的菌株大都具有明確的降解污染物的功能.其中與條帶 1相似度達99%的Thalassospira xiamenensis是Liu等[26]從廢油池中分離出的石油烴降解菌.其他條帶對應的最大相似菌株,雖然沒有報道表明具有降解污染物的功能,但是大都來源于海洋和含鹽土壤,屬于嗜鹽細菌.

表3 菌群中的優勢種屬隨甲苯加入的變化Table 3 Dominant bacteria in the consortium before and after adding toluene

由圖2和表3可見,經5%鹽度LB培養基活化后的菌群群落(泳道 LB)在甲苯馴化 3d以后(泳道0h),條帶4,5,8,9和11消失,條帶6亮度變淺,并出現條帶2,3,7,10和16.在加入甲苯前,菌群中的優勢種主要為 Bacillus;加入甲苯馴化后菌群中開始出現 Thalassospira xiamenensis和Pseudomonas stutzer,這表明它們能夠耐受高濃度的甲苯,與甲苯的降解有關;馴化時消失的Bacillus sp. hyss67、Bacillus aquimaris 12-4、Bacillus sp. 122004、Bacillus sp. 85-4和Bacillus aquaemaris TF-12,可能無法耐受甲苯.而在降解過程中,條帶1,2,3,7,10,12,14和15始終穩定存在,表明 Thalassospira xiamenensis、Pseudomonas stutzeri、Virgibacillus、Bacillus在甲苯降解過程中起到重要作用.這一現象與上述種屬已知功能是相符的.其中,優勢條帶7在降解過程中亮度不斷增強并在72h時達到最大(此時甲苯降解率達75%),此后 3d亮度有所下降,但是仍高于前 72h水平.另一條優勢條帶 15,在降解過程中亮度沒有明顯的變化,表明該條帶對應菌株在群落中的相對含量始終較為穩定.鑒于條帶7,條帶15的優勢地位,與它們相似度最高的 Pseudomonas stutzeri和Bacillus sp. M1 5-5在降解中可能起到了最為關鍵的作用.這一現象與這 2株菌已知的功能相符:與條帶 7相似度達到 99%的 Pseudomonas stutzeri 能降解多環芳烴,與條帶15相似度達到99%的Bacillus sp. M1 5-5是苯并[a]芘降解菌群的組分.盡管接種后120h已檢測不到甲苯存在,但主要條帶并未觀察到明顯的亮度下降,表明菌群中的優勢菌株在降解結束后并不會立刻進入衰亡期,其優勢狀態還會持續.

2.3 菌群對多環芳烴的降解

在培養基中添加 0.02%酵母提取物時,菲在第11d的降解率為47.96%(圖4).這一現象與對菌群的系統發育分析結果是一致的:與條帶1相似度達99%的Thalassospira xiamenensis是石油烴降解菌;與條帶 7相似度達到 99%的 Pseudomonas stutzeri 是多環芳烴降解菌;與條帶15相似度達到99%的Bacillus sp. M1 5-5是苯并[a]芘降解菌群的組分.這一結果顯示了該菌群降解底物的多樣性,在實際生物修復中具有良好的應用前景.

圖3 菌群對菲的降解Fig.3 Biodegradation of phenanthrene by the corsortium

3 結論

3.1 菌群在5%鹽度下可以完全降解苯、甲苯、苯和甲苯混合物(1:1)、BTEX(苯:甲苯:乙苯:二甲苯＝1:1:1:1). 另外,該菌群可以降解菲,11d的降解率為47.96%.

3.2 在以甲苯為底物培養時,菌群群落結構發生顯著變化,優勢種屬由Bacillus sp.和Bacillus aquimaris轉變為 Thalassospira xiamenensis、Pseudomonas stutzeri、Virgibacillus sp.和Bacillus sp..

3.3 在 5%鹽度下,Thalassospira xiamenensis、Pseudomonas stutzeri、Virgibacillus和 Bacillus在甲苯降解過程中的優勢種屬.在整個過程中,菌群群落結構穩定,并在降解完成后 24h內沒有衰亡的跡象.

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Analysis of bacterial community structure in toluene degradation by a halophilic consortium.

JIANG Jing1, WANG Hui1*, ZHANG Li-hua2, MAO Xin-wei1, YAN Hai2
(1.State Key Joint Laboratory on Environmental Simulation and Pollution Control, Department of Environmental Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China；2.College of Applied Science, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China). China Environmental Science, 2010,30(2)：216～221

X172

A

1000-6923(2010)02-0216-06

2009-04-07

國家自然科學基金資助項目(30970098,2073001);國家重點實驗室專項基金課題(09Y03ESPCT)

* 責任作者, 副教授, wanghui@mail.tsinghua.edu.cn

蔣 婧(1984-),女,湖北武漢人,清華大學環境科學與工程系碩士研究生,主要從事環境微生物研究.