一株溶藻細(xì)菌對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響及其鑒定

晉 利,劉兆普,趙耕毛,汪 輝,陳 雷

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

一株溶藻細(xì)菌對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響及其鑒定

晉 利,劉兆普*,趙耕毛,汪 輝,陳 雷

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

從山東黃島邊某富營(yíng)養(yǎng)化池塘中分離得到1株具有溶藻作用的菌株(J1),研究了其對(duì)銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)的抑制效果、作用方式以及細(xì)菌培養(yǎng)基、菌株與銅綠微囊藻不同生長(zhǎng)階段等因素對(duì)溶藻效果的影響,并對(duì)該菌株進(jìn)行了生理生化鑒定.結(jié)果表明,將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加入藻液,培養(yǎng)基與藻液的投放體積比為6%時(shí),9d內(nèi)對(duì)藻的生長(zhǎng)無影響.將初始濃度為6×107cfu/mL的菌液加入藻液,共培養(yǎng)第9d,銅綠微囊藻的去除率達(dá)87%以上.對(duì)數(shù)期的J1細(xì)菌具有較好的溶藻效果,作用于穩(wěn)定期銅綠微囊藻的實(shí)驗(yàn)組,藻的去除率較低.J1通過分泌溶藻物質(zhì)的間接作用方式抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng),且溶藻活性物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性.根據(jù)生理生化及16S rDNA序列分析鑒定,菌株J1屬于芽胞桿菌屬(Bacillus).

溶藻細(xì)菌；銅綠微囊藻；溶藻作用；16S rDNA；芽胞桿菌

Abstract：An algae-lysing bacterium strain named J1 was isolated from an eutrophic pond around Huangdao. The lytic efficiency and performing mode of bacterial lysing of Microcystis aeruginosa were studied. Influences of the bacterial culture medium and the growth phases of bacterium and algae on the antialgal effect were also studied, and then the bacterium strain was physiologically and biochemically identified. The results showed that algae growth was relatively stable with adding beef-protein medium without bacterium strain when the volume ratio of medium to algae solution was 6%. However, more than 87% of Microcystis aeruginosa had been removed by 9 days after adding the beef-protein medium with initial bacterium concentration of 6×107cfu/mL under the same volume ratio. The antialgal efficiency was different to the various growth phages of bacterium and algae. J1 in log growth phase showed the best algae-lysing performance. The removal rate of algae in stable phrase was the lowest under the treatment with J1 in log growth phase. J1 excreted algae-lysing substance to inhibit the algae growth indirectly, and this active inhibitors were heat-stable. According to the morphological and physiological-biochemical characteristics, bacterium J1 was identified as Bacillus.

Key words：algae-lysing bacterium；Microcystis aeruginosa；algae-lytic effect；16S rDNA；Bacillus

富營(yíng)養(yǎng)化已成為眾多水體普遍存在的環(huán)境問題.利用溶藻細(xì)菌作為水華和赤潮防治的生物,已經(jīng)引起越來越多人的關(guān)注[1].部分研究者認(rèn)為水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻細(xì)菌的感染有關(guān)[2].Doucette等[3]曾報(bào)道在水華和赤潮的發(fā)生、發(fā)展和消亡過程中,細(xì)菌以及細(xì)菌與藻類的相互作用是影響藻類生長(zhǎng)的關(guān)鍵性的調(diào)控因素.由于自然界水體中溶藻細(xì)菌比率較低[4],分離較困難,目前國(guó)內(nèi)的研究也多處于起步階段.本實(shí)驗(yàn)室從山東黃島邊某富營(yíng)養(yǎng)化池塘分離出一株具有溶藻作用的菌株 J1,首先研究了細(xì)菌液體培養(yǎng)基自身對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng),并在排除培養(yǎng)基影響的合理體積投入量范圍內(nèi),進(jìn)一步研究了細(xì)菌培養(yǎng)液對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng),同時(shí)利用16S rDNA序列分析方法進(jìn)行鑒定,為更深入地探討藻菌關(guān)系、研究溶藻細(xì)菌提供參考.

1 材料與方法

1.1 藻種來源及其培養(yǎng)、計(jì)量

實(shí)驗(yàn)藻種為銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa) FACHB469,取自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種保藏中心.藻種經(jīng)活化后,采用BG11改良培養(yǎng)基[5],在溫度為25℃,光照強(qiáng)度為2500lx,光暗比為12h:12h的條件下培養(yǎng).通過測(cè)量葉綠素a(Chl.a)的含量及顯微觀察了解銅綠微囊藻的生長(zhǎng)情況,葉綠素a的測(cè)量采用丙酮法[6].藻的去除率R定義為:R=(C0-Ce)/C0,式中:C0為對(duì)照樣銅綠微囊藻葉綠素a的含量,μg/L;Ce為處理樣銅綠微囊藻葉綠素a的含量,μg/L.

1.2 細(xì)菌的分離及其培養(yǎng)、計(jì)量

實(shí)驗(yàn)菌種分離自黃島邊某富營(yíng)養(yǎng)化池塘.從該池塘中采集水樣,按 10%的比例接入培養(yǎng) 14d的銅綠微囊藻藻液中,25℃共培養(yǎng) 7d.取黃化藻液按不同濃度梯度稀釋,采用平板涂布和劃線的方法分離細(xì)菌.細(xì)菌的培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,置于 30℃,170r/min,搖床培養(yǎng).將各菌株培養(yǎng)液等量加入到銅綠微囊藻藻液中,得到能夠使藻液發(fā)生黃化現(xiàn)象的菌株 J1.細(xì)菌的計(jì)量采用稀釋平板測(cè)數(shù)法[7].

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)藻生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)銅綠微囊藻至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,分別取不加入細(xì)菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 0,2,4,6,8, 10mL加入100mL處于對(duì)數(shù)期的藻液中,每組各設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),每隔2d測(cè)1次葉綠素a的含量.

1.4 細(xì)菌投入量對(duì)溶藻效果的影響

將 J1菌株液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(107cfu/mL),分別取菌液0,2,4,6,8,10mL加入100mL處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的藻液中,各設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),每隔2d測(cè)1次葉綠素a的含量.

1.5 J1細(xì)菌生長(zhǎng)階段對(duì)銅綠微囊藻溶藻效果的影響

將J1菌株液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期,分別取處于不同生長(zhǎng)階段的菌液6mL加入100mL處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的藻液中,菌株的每個(gè)生長(zhǎng)階段各設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)及空白對(duì)照,每隔2d測(cè) 1次葉綠素a的含量.

1.6 銅綠微囊藻的生長(zhǎng)階段對(duì)溶藻效果的影響

將銅綠微囊藻液體培養(yǎng)至適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期,分別在處于不同生長(zhǎng)階段的100mL藻液中加入6mL處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的J1菌液,藻液的每個(gè)生長(zhǎng)階段各設(shè) 3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)及空白對(duì)照,每隔2d測(cè)1次葉綠素a的含量.

1.7 J1菌株溶解銅綠微囊藻的作用方式

培養(yǎng)細(xì)菌至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,分別取6mL菌體浸提液(細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)8000r/min,4℃離心10min,棄上清,重復(fù)洗滌2～3次,置于70℃,水浴20h)、菌體(細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)8000r/min,4℃離心10min,棄上清)、高熱處理的菌液上清(菌液經(jīng)8000r/min,4℃離心10min,取上清液在121℃下處理30min)、離心濾過的菌液上清(離心得上清液再經(jīng) 0.22μm濾膜過濾)、菌液加入100mL處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的藻液中,各設(shè) 3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)及空白對(duì)照,每隔 2d測(cè)1次葉綠素a的含量.

1.8 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定采用比濁法,具體操作參照文獻(xiàn)[7].

1.9 細(xì)菌生理及分子鑒定

生理生化鑒定參照文獻(xiàn)[8];16SrDNA序列分析:按Pitcher法提取細(xì)菌的基因組總DNA;以提取的 DNA 為模板,采用通用引物進(jìn)行16SrDNA基因擴(kuò)增,上游引物為 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′.PCR反應(yīng)體系為50μL,包括10×PCR緩沖液 5μL,dNTP(20mmol/L)4μL,引物(25pmol/μL)各2μL,Mg2+(25mmol/L)4μL,菌體DNA (約 50ng/μL)1μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,加水至50μL,反應(yīng)條件:94℃變性2min;94℃1min,個(gè)循環(huán);72℃延伸20min.PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)純化后,送由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序工作.

2 結(jié)果

2.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的不同投入量對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)影響的情況如圖1所示,與對(duì)照(投入量為0)相比,直至實(shí)驗(yàn)第3d,各瓶藻液葉綠素a含量基本相當(dāng).從實(shí)驗(yàn)第6d開始,加入8,10mL培養(yǎng)基的處理組葉綠素 a含量低于對(duì)照,觀察加入2,4,6mL培養(yǎng)基的處理組, 9d后才出現(xiàn)這一現(xiàn)象.說明牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與藻液的的投放體積比小于 6%時(shí),短期內(nèi)(9～10d)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組無顯著性差異(P>0.05),即培養(yǎng)基對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)無顯著影響.

圖1 細(xì)菌培養(yǎng)基投入量對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a的影響Fig.1 The effects of bacterial culture medium volume on Chl.a of Microcystis aeruginosa

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)液投入量對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

圖2 細(xì)菌培養(yǎng)液投入量對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a的影響Fig.2 The effects of bacterial culture liquid volume on Chl.a of Microcystis aeruginosa

由圖2可見,細(xì)菌培養(yǎng)液投入量為 2mL時(shí),直至實(shí)驗(yàn)第9d,藻液葉綠素a的含量仍高于對(duì)照,從第 10d開始,細(xì)菌培養(yǎng)液處理的藻液中葉綠素a的含量開始顯著下降,表現(xiàn)出對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制.細(xì)菌培養(yǎng)液投入量為4,6,8,10mL的處理組藻液中葉綠素 a的含量在整個(gè)共培養(yǎng)期始終低于對(duì)照,在實(shí)驗(yàn)第9d時(shí),葉綠素a的含量分別為對(duì)照的63.8%、17.0%、16.6%、18.4%,實(shí)驗(yàn)第12d至第15d,葉綠素a的含量繼續(xù)降低,特別是投入量為6,8,10mL菌液的處理組葉綠素a含量幾乎為0.對(duì)比圖1、圖2,排除培養(yǎng)基自身對(duì)藻生長(zhǎng)的影響,本實(shí)驗(yàn)菌液最適投入量為6mL,濃度約為6×107cfu/mL.

2.3 J1細(xì)菌和銅綠微囊藻所處生長(zhǎng)階段對(duì)溶藻效果的影響

圖3 菌株J1和銅綠微囊藻所處生長(zhǎng)階段對(duì)溶藻效果的影響Fig.3 The effects of the growth phases of bacterium J1 and Microcystis aeruginosa on algicidal effect

實(shí)驗(yàn)表明,處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的 J1細(xì)菌對(duì)銅綠微囊藻溶解效果較好,處于穩(wěn)定期與衰亡期的 J1細(xì)菌溶藻效果相當(dāng).如圖 3a所示,實(shí)驗(yàn)第9d,J1對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期處理組藻的去除率分別為87.4%、74.7%、73.2%.同時(shí),處于不同生長(zhǎng)階段的銅綠微囊藻,在相同 J1細(xì)菌處理下,溶藻效果亦有差異,處于穩(wěn)定期的藻的實(shí)驗(yàn)組,其去除率低于處于適應(yīng)期與對(duì)數(shù)期的實(shí)驗(yàn)組.由圖3b可見,實(shí)驗(yàn)第9d,銅綠微囊藻適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期處理組藻的去除率分別為92.3%、89.4%、78.6%.

2.4 J1菌株溶藻的作用方式

由圖4可見,相比于對(duì)照,J1菌體浸提液、菌體處理組幾乎無溶藻效果,即細(xì)菌不是通過與藻細(xì)胞直接接觸的方式抑制藻生長(zhǎng).在銅綠微囊藻藻液初始葉綠素 a濃度為 1940μg/L時(shí),第9d,對(duì)照組藻液葉綠素 a上升至 3660μg/L,而高熱處理的上清液、離心濾過的上清液、細(xì)菌培養(yǎng)液處理組葉綠素 a的含量分別為 620,480, 380μg/L,溶藻效果顯著,即細(xì)菌通過分泌到胞外的活性物質(zhì)間接溶藻,且活性物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性.

圖4 細(xì)菌培養(yǎng)液不同處理方式對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a的影響Fig.4 The effects of bacterial culture liquid treated with different methods on Chl.a of Microcystis aeruginosa—◆—對(duì)照 —■—菌體浸提液 —●—細(xì)菌培養(yǎng)液—×—菌液上清 —＋—高熱處理的菌液上清 —▲—菌體

2.5 J1細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖5可見,細(xì)菌的停滯期在2h左右,2h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,至 34h左右達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期,第49h左右進(jìn)入衰亡期.

圖5 菌株J1的生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curve of bacteria J1

2.6 J1細(xì)菌生理及分子鑒定

J1菌株在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落呈圓形,表面較為干燥、不透明,邊緣略呈鋸齒狀,革蘭氏陽性菌,能夠水解淀粉、油脂和明膠,檸檬酸鹽、甲基紅、伏-普試驗(yàn)呈陽性,吲哚反應(yīng)呈陰性.

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為 1.5kb,其電泳圖譜見圖6.獲得的16SrDNA序列已在GenBank注冊(cè),注冊(cè)號(hào)為 FJ815201,用 Blast程序?qū)?J1的16SrDNA序列和GenBank中已登陸的16SrDNA序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與多株芽孢桿菌的同源性極高,再結(jié)合生理生化指標(biāo)可以推斷出,實(shí)驗(yàn)菌株屬于芽孢桿菌屬,J1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7.

圖6 J1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.6 The amplification of J1 16SrDNA 1為J1菌株,2為陰性對(duì)照

3 討論

銅綠微囊藻是引起水華現(xiàn)象的優(yōu)勢(shì)藻種之一.溶解銅綠微囊藻的細(xì)菌以前也曾有報(bào)道.Yamamoto等[9-10]指出,存在于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊中的假單胞菌是湖泊中能夠溶解藍(lán)藻的主要菌株,并從湖泊底泥中分離出一株可抑制銅綠微囊藻的鏈霉菌.汪輝等[11]自池塘中分離出一株無色桿菌屬的細(xì)菌亦具有良好的溶藻效果.彭超、裴海燕等[12]曾報(bào)道芽胞桿菌對(duì)銅綠微囊藻有抑制作用.本研究所篩選到的溶藻細(xì)菌亦屬于芽胞桿菌屬,對(duì)銅綠微囊藻的溶解作用表現(xiàn)為藻液變黃,有少許沉淀,顯微鏡下觀察,藻細(xì)胞破碎.

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基屬細(xì)菌常用培養(yǎng)基,研究表明,在其與藻液投放比為6%時(shí),從實(shí)驗(yàn)第9d之后,才出現(xiàn)此培養(yǎng)基對(duì)藻生長(zhǎng)的抑制.對(duì)比實(shí)驗(yàn)第 12d,培養(yǎng)基處理組與菌液處理組分別為38.8%和95.3%的藻的去除率,說明后者對(duì)藻的抑制占主導(dǎo)地位,且直至第 15d,這一抑制優(yōu)勢(shì)有增無減,說明菌液對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用具有很強(qiáng)的持續(xù)性.除菌液投放比為 2%的處理外,其它菌液處理組在實(shí)驗(yàn)初期即表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑藻效果,說明溶藻活性物質(zhì)需要一定的作用濃度.另菌液投放比為6%、8%、10%的處理組,溶藻效果無明顯區(qū)別,說明對(duì)于定量藻液,溶藻活性物質(zhì)有一定的作用飽和濃度.

圖7 菌株J1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree of strain J1

J1菌株對(duì)銅綠微囊藻的溶解效果受到菌株及銅綠微囊藻所處生長(zhǎng)階段的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)菌具有較好的溶藻效果,處于穩(wěn)定期、衰亡期的細(xì)菌,其溶藻效果低于前者,可能是由于細(xì)菌對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)旺盛,酶活高,分泌胞外溶藻活性物質(zhì)較多,而這些活性物質(zhì)在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少的生長(zhǎng)后期作為二次營(yíng)養(yǎng)物被再次利用,沒有在穩(wěn)定期及衰亡期得到充分的積累;而對(duì)處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期的銅綠微囊藻,該細(xì)菌溶藻效果較差,可能因?yàn)樘幱诜€(wěn)定期的銅綠微囊藻,相較于適應(yīng)期和對(duì)數(shù)期而言,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少,胞外分泌物增加,對(duì)藻起到了一定的保護(hù)作用,從而藻的去除率下降,有報(bào)道[13]稱,胞外分泌物能夠起到抵抗抗生素、原生動(dòng)物捕食的保護(hù)屏障作用.

溶藻細(xì)菌作用方式,一般分為下列 2種情況[14]:直接溶藻,需要細(xì)菌與藻細(xì)胞直接接觸;間接溶藻,主要包括細(xì)菌同藻競(jìng)爭(zhēng)有限營(yíng)養(yǎng)或細(xì)菌分泌胞外物質(zhì)溶藻.本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)細(xì)菌及其培養(yǎng)液進(jìn)行離心,過濾、浸提、高熱處理,得知J1菌株間接溶藻,且分泌到胞外的溶藻活性物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性.目前已報(bào)道的細(xì)菌胞外殺藻物質(zhì)主要有以下幾類:蛋白質(zhì)[15];多肽[16];氨基酸[17];抗生素[5];含氮化合物[18];其他未鑒定的殺菌物質(zhì)[11].本實(shí)驗(yàn)所涉及的溶藻活性物質(zhì)有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

4.1 J1菌株對(duì)銅綠微囊藻有較好的溶解效果,按6%的體積比向藻液中加入菌液,實(shí)驗(yàn)第9d,藻的去除率達(dá) 87%以上.J1作用初始濃度應(yīng)大于2×107cfu/mL,且在一定的菌液濃度范圍內(nèi),初始濃度越大,溶藻效果越好.

4.2 J1菌株的生長(zhǎng)階段與銅綠微囊藻的生長(zhǎng)階段對(duì)溶藻效果均有影響,但作用趨勢(shì)基本相同.該菌株屬間接溶藻,胞外溶藻活性物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性.

4.3 J1菌株革蘭氏染色陽性,與多株芽胞桿菌的16SrDNA核苷酸序列的同源性極高,屬于芽胞桿菌屬.

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JIN Li, LIU Zhao-pu*, ZHAO Geng-mao, WANG Hui, CHEN Lei
(Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province, College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). China Environmental Science, 2010,30(2)：222～227

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A

1000-6923(2010)02-0222-06

2009-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30600086)

? 責(zé)任作者, 教授, sea@njau.edu

晉 利(1983-),女,河北張家口人,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境與科學(xué)學(xué)院碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物方面的研究.