基于SCGE的五氯酚對稀有鮈鯽DNA損傷的研究

馬永鵬,王 燕,朱祥偉,劉樹深,劉 堰*

(1.西南大學生命科學學院,三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400715；2.同濟大學環境科學與工程學院,長江水環境教育部重點實驗室,上海 200092)

基于SCGE的五氯酚對稀有鮈鯽DNA損傷的研究

馬永鵬1,王 燕1,朱祥偉2,劉樹深2,劉 堰1*

(1.西南大學生命科學學院,三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400715；2.同濟大學環境科學與工程學院,長江水環境教育部重點實驗室,上海 200092)

采用單細胞凝膠電泳(SCGE)技術,研究了在不同的染毒時間內不同濃度的五氯酚(PCP)對稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)血細胞和肝臟細胞DNA的損傷.結果顯示,各PCP染毒組細胞彗星尾部DNA含量 (%DNAT) 和彗星尾長(TL) 顯著增加,與空白對照組比較,差異極顯著(P<0.05).隨著濃度的增加,細胞彗星尾部%DNAT和 TL逐漸增加,其相關系數>0.926,說明在實驗濃度范圍內, 存在顯著的濃度-效應關系.在同一濃度下,隨著暴露時間的增加,處理組%DNAT和TL逐漸增加,存在顯著的時間-效應關系.由于PCP可引起稀有鮈鯽血細胞和肝臟細胞DNA的嚴重損傷,因此稀有鮈鯽血細胞和肝臟細胞DNA的損傷可作為PCP遺傳毒性的指示.

五氯酚；稀有鮈鯽；DNA損傷；單細胞凝膠電泳(SCGE)；遺傳毒性

Abstract：By using the alkaline single cell gel-electrophoresis (SCGE), the DNA damage in blood cells and liver cells of Gobiocypris rarus caused by pentachlorophenol at different exposure time (1day, 4days, 7days) with different concentration of pentachlorophenol (40, 100, 160μg/L) was evaluated. Tail DNA percentage (%DNAT) and tail length (TL) of the three tested groups were significantly different from the control group (P < 0.05). Furthermore, the damage intensity of treated groups increased gradually with respect to the increasing of pentachlorophenol. The concentration-effect relationship was significant for the correlation coeffiencient was graeter than 0.926. Under the same concentration, the % DNAT and TL increased gradually with the time of exposure. The time-effect relationship was also significant. This study recommended that it could be a sensitive monitor of aquatic pollution to use the SCGE to detect the DNA damage in fish blood cells and liver cells. It showed that this assay could be applied in the assessment of water pollution and aquatic mutagens.

Key words：pentachlorophenol；gobiocypris rarus；DNA damage；alkaline single cell gel electrophoresis (SCGE)；genotoxicity

五氯酚(PCP)是一種典型的持久性有機污染物(POPs),是環境優先監測污染物之一,被國際腫瘤研究機構[1]和美國環境保護局[2]列為人類可能的致癌物.在我國,PCP及其鈉鹽主要作為殺蟲劑和木材防腐劑而廣泛應用,曾在長江中下游 11個省、市被大范圍、長時間地用于殺滅釘螺,導致對水環境的污染[3].PCP對細菌、高等植物細胞、小鼠和人淋巴細胞都具有遺傳毒性[4-7],但其作為一種誘變劑或輔誘變劑的研究有限[8],并且對 PCP遺傳毒性的研究觀點不一[9].因此,研究PCP對水生生物和水體生態系統的遺傳毒性影響具有重要意義.

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)是我國特有的一種卵生小型鯉科魚類,具有生命力強、飼養簡便、性成熟快、周年產卵等[10]優點.已有研究[11]結果顯示,稀有鮈鯽是一種對化學物質較敏感的試驗動物.近年來,單細胞凝膠電泳試驗(SCGE,又稱彗星試驗)由于其快速、敏感、經濟等優點,正越來越多地被用于環境污染物的遺傳毒性評價[12].本研究以稀有鮈鯽為研究對象,通過SCGE研究PCP對稀有鮈鯽血細胞和肝臟細胞DNA的損傷效應,以期為水體環境的生物監測、篩選水環境中基因毒劑指標提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

PCP純度 99%,(Chem.Service);三羥甲基氨基甲烷(Tris)(AMRESCO);二甲基亞砜(DMSO) (Sanland-Chem);正常熔點瓊脂糖(上海化學試劑公司);低熔點瓊脂糖(北京經科宏達生物技術有限公司);溴化乙錠,臺盼藍(美國 Sigma公司); TritonX-100 (北京奇華盛生物技術發展中心);其他試劑均為國產分析純.

微量高速冷凍離心機(德國 Hettich ZENTRIFUGEN 公司),水平電泳槽和 DYY-6B型電泳儀(北京六一儀器廠),熒光顯微鏡(Elicspe 80i型,Nikon,日本),120目細胞篩.

1.2 實驗動物

健康的稀有鮈鯽種魚購于中國科學院武漢水生生物研究所,在本實驗室飼養繁殖,水溫控制在 25℃左右,光照周期為晝/夜=14h/10h.全部喂養孵化的豐年蟲(豐年蟲卵購于天津丹陽水產有限公司).試驗用魚為 7個月齡的健康成魚[體重(0.53±0.15)g,體長(36.6±3.7)mm].實驗前,以連續曝氣 24h的自來水,[pH為(7.6±1.5),DO>5mg/L,總硬度為(7.8±0.7)德國度,水溫(25±2)℃];晝/夜=14h/12h的試驗條件馴化2周.

1.3 暴露試劑

PCP溶于DMSO,制成10mg/mL的儲液,4℃保存.再用 DMSO進一步稀釋至各濃度,置于棕色瓶4℃保存.

1.4 動物分組及染毒方式

將稀有鮈鯽隨機分成空白對照組、溶劑對照組和40,100,160μg/L PCP濃度組,每組10條魚.暴露試驗在10L體系中進行,水溫(25±2)℃,晝/夜=14h/12h,每天更換一半體積的暴露溶液,并補加暴露試劑至原濃度;喂食剛孵化的豐年蟲1次;觀察魚是否有異常,并記錄.分別在第1,4,7d各取3條魚用于試驗.

1.5 樣品的收集和細胞懸液的制備

血細胞懸液:斷尾法取稀有鮈鯽外周血10μL,迅速加入0.2mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS,pH 7.4)中制成血細胞懸液,置于4℃冰箱中保存待用.

肝臟細胞懸液:取下肝臟,立即用預冷的PBS沖洗 3次以去除血細胞,然后加入適量預冷的PBS,剪碎,用120目的不銹鋼篩網過濾,收集細胞懸液,用 PBS調細胞濃度至 107～108/mL用作SCGE實驗,置于4℃冰箱中保存待用.

各組細胞經臺盼藍染色后,細胞計數,活細胞率均在87%以上.

1.6 SCGE實驗

操作步驟參照文獻[13]的方法,加以適當改進.

制膠(雙層凝膠法):第一層鋪正常熔點的瓊脂糖凝膠(0.6%:用 PBS配制),采用浸片法,將載玻片浸入凝膠中數秒后,取出用紙把背面擦凈,然后水平放置在 60℃烘箱中烘干.第二層鋪60μL的低熔點瓊脂糖凝膠(0.7%:用 PBS配制)與20μL細胞懸液的混合液,蓋上蓋玻片,置4℃冰箱冷卻.

細胞裂解:移去蓋玻片,將載玻片水平浸入新鮮配制并預冷的細胞裂解液中避光裂解2h.

解旋:將載玻片取出,置蒸餾水中漂洗 1次,然后置于水平電泳槽的陽極端,將新配制的堿性電泳緩沖液(1 mmol/L的EDTA-2Na,300mmol/L的NaOH,pH 13)加入電泳槽中,約覆蓋過載玻片膠面 0.25cm,4℃下避光靜置20min.

電泳:電壓 25V,4℃,調節電泳緩沖液液面高度使電流為300mA,避光電泳20min.電泳結束后,將載玻片用PBS(pH 7.4)緩沖液浸洗,每次5min,共3次.中和后,吸去玻片上的殘液,然后放入無水乙醇中浸泡5min,取出晾干,避光室溫保存.

滴加30μL 5μg/mL溴化乙錠到膠體表面,蓋上蓋玻片染色.染色20min以后,開始熒光顯微鏡觀察.數碼相機拍照,每份樣本隨機拍攝 100個DNA受損細胞圖像,彗星圖像用 CASP軟件[14]自動分析,選用國際公認的彗星尾部 DNA含量(%DNAT)和彗星尾長(TL)來評價DNA的損傷程度.分析所得數據用 SPSS13.0軟件,在方差齊性的情況下用單因素方差分析其統計學意義(α=0.01),同時對%DNAT與PCP濃度和血液與肝臟細胞的損傷之間進行相關性分析.

2 結果

2.1 稀有鮈鯽外周血細胞和肝臟細胞 DNA受損形態及彗星尾長分析

對照組和各PCP染毒組彗星圖像如圖1和圖2所示.不同濃度PCP對稀有鮈鯽血細胞和肝細胞DNA損傷的彗星尾長分析如表1所示.由圖1可見,空白對照組和溶劑對照組的血細胞和肝臟細胞核大小比較均一,呈圓形熒光團,無拖尾現象(圖1A、B).DNA受損的血細胞和肝臟細胞有一個像彗星一樣的拖尾,并且隨著 PCP濃度的增加,彗星尾長顯著增加(表1,P<0.05),尾部熒光強度增強,彗星頭部的直徑隨著尾部的加長而減小(圖1C、D、E),其損傷作用表現出顯著的濃度效應.在相同PCP濃度下,受損DNA彗星的尾長、尾部熒光強度、彗星頭部的直徑都隨暴露時間的增加,表現出顯著的時間效應(圖2A、B、C;表1).

圖1 第4d PCP引起稀有鮈鯽血細胞DNA受損形態(×200)Fig.1 Comet pictures of DNA damage induced by pentachlorophenol after 4 days (×200)A:空白對照組;B:溶劑對照組;C:40μg/LPCP處理組;D:100μg/LPCP處理組;E:160μg/LPCP處理組

圖2 100μg/L PCP不同時間引起稀有鮈鯽肝細胞DNA受損形態(×200)Fig.2 Comet pictures of DNA damage induced by 100μg/L of pentachlorophenol in different exposure time (×200)

表1 不同濃度PCP下稀有鮈鯽血細胞和肝細胞DNA的TLTable 1 Comet tail length in blood cells and liver cells of Gobiocypris rarus exposed to three different sub-lethal concentrations of PCP

2.2 PCP對稀有鮈鯽外周血細胞和肝臟細胞DNA損傷的影響及濃度-效應關系

不同濃度?不同處理時間PCP對稀有鮈鯽血細胞和肝臟細胞DNA的損傷效應如圖3所示;以%DNAT,對PCP濃度作線性回歸,得到的濃度-效應方程如表2所示.經統計學檢驗,同一處理時間,各濃度組%DNAT與對照組之間有極顯著性差異(P<0.01),在 40μg/LPCP處理組暴露 1d時,血細胞和肝細胞%DNAT分別為(8.23±0.73)%和(10.53±0.57)%,與空白對照組(4.16±0.96)%; (4.57±0.39)%相比已出現明顯變化(圖 3);在高濃度PCP處理組(100,160μg/L)中,其損傷顯著增加,其中 160μg/LPCP處理組的血細胞和肝細胞%DNAT分別為(10.63±0.57)%和(14.29±0.42)%,且隨著 PCP處理濃度的增加,血細胞和肝細胞%DNAT均逐漸升高,表明PCP可導致稀有鮈鯽血?肝細胞DNA損傷,且隨處理濃度的增加,損傷逐漸加重,呈一定的濃度-效應關系,其相關系數>0.926;同一處理濃度,隨著PCP處理時間的加長,血細胞和肝細胞%DNAT也呈逐漸升高趨勢,其40μg/LPCP處理組暴露 7d時,血細胞和肝細胞%DNAT分別為(19.47±0.81)%和(21.16±0.28)%,可見,隨處理時間的增加,損傷逐漸加重,呈一定的時間-效應關系.同時,對血液和肝臟細胞之間的損傷進行相關性分析得知,相關系數R=0.982.

表2 稀有鮈鯽血細胞和肝細胞%DNAT 與PCP的濃度-效應方程Table 2 Concentration-effect equation [0] of %DNAT and PCP in blood cells and liver cells of Gobiocypris rarus

圖3 PCP處理組稀有鮈鯽外周血細胞和肝臟細胞%DNATFig.3 %DNAT in blood cells and liver cells [0] of Gobiocypris rarus induced by pentachlorophenol?表示與空白對照組相比,P<0.05;??表示與空白對照組相比,P<0.01

3 討論

PCP是一種典型的水體污染物,其不僅影響生物生生 ?誘導生物細胞毒性,而且還可能誘導生物的遺傳損傷.Pavlica等[15]研究了PCP對斑馬貝血細胞的影響,結果發現,其可致斑馬貝血細胞出現 DNA鏈斷裂損傷.本研究結果顯示, PCP可導致稀有鮈鯽血細胞和肝臟細胞 DNA明顯的斷裂和遷移,對血細胞和肝臟細胞 DNA造成了損傷.

Pavlica等[16]觀察到 PCP誘導斑馬貝和大蝸牛微核率增加,隨著暴露天數延長,在較低濃度下也出現微核細胞頻率增加的結果.本研究發現,在低濃度PCP暴露7d后,稀有鮈鯽血細胞和肝臟細胞%DNAT顯著增加.用低濃度的PCP處理動物時,可增加動物對氧的消耗,這是由于在線粒體內氧化磷酸化的解偶聯使線粒體缺少對呼吸的控制所導致的[17].而氧的過量消耗將會產生過多的氧化自由基[18],其可致氧化DNA損傷,這可能是 PCP遺傳毒性的一個機制[19].Sai-Kato等[20]研究PCP對小鼠肝臟DNA損傷時,發現使用抗氧化劑以后,其DNA損傷明顯降低.還有研究[21]發現,PCP導致細胞內ATP大量消耗,致使細胞內Ca2+濃度上升,激活了核酸內切酶,造成大量DNA片段的產生,這可能是PCP造成DNA損傷的另一個機制.本次試驗中,稀有鮈鯽經PCP處理以后,可能增加了活性氧的媒介物,產生過多的氧化自由基從而導致血細胞和肝臟細胞DNA發生氧化損傷.

有研究顯示[22],Na-PCP可在魚的肝臟、腎臟等器官內大量蓄積,造成肝、腎及中樞神經系統嚴重損害,破壞生物體內的電子傳遞體系和造成氧化損傷,從而對生物體造成一定的 DNA損傷?本次研究結果發現,稀有鮈鯽的肝臟細胞較血細胞DNA損傷嚴重,這表明肝臟細胞更容易受到損傷而造成 DNA鏈斷裂.通過相關性分析得知,PCP對稀有鮈鯽血液和肝臟細胞 DNA的損傷效應呈很好的相關性,因此,稀有鮈鯽的血液和肝臟細胞均可作為PCP遺傳毒性的靈敏的指示器.

4 結論

4.1 PCP在40～160μg/L的試驗濃度下,經1～7d暴露后引起稀有鮈鯽血細胞和肝細胞DNA顯著損傷.

4.2 PCP對核酸物質具有較強的毒性,能導致大量 DNA片段的產生.通過線性回歸分析得到,PCP的濃度與DNA損傷存在顯著的濃度-效應關系,其相關系數>0.926.因此,稀有鮈鯽血細胞和肝細胞DNA損傷均可作為PCP遺傳毒性的靈敏的指示器.

[1] International Agency for Research on Cancer. Pentachlorophenol (group 2B). IARC monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans [M]. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1991:371.

[2] Environmental Protection Agency. Pentachlorophenol (CASRN 87-86-5) [S]. Washington, D C: Environmental Protection Agency, 2001.

[3] 張 兵,鄭明輝,劉芃巖,等.五氯酚在洞庭湖環境介質中的分布[J]. 中國環境科學, 2001,21(2):165-167.

[4] Roy S, Hanninen O. Pentachlorophenol: uptake/elimination kinetics and metabolism in an aquatic plant, Eichornia crassipes [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 1994,13:763-773. [5] Pavlica M, Vasilevska J, Papes D. Genotoxicity of pentachlorophenol revealed by Allium chromosome aberration assay [J]. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 1999,40: 85-90.

[6] Gopalaswamy U V, Nair C K K. DNA binding and mutagenicity of lindane and its metabolites [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1992,49:300-305.

[7] Ziemsen B, Angerer J, Lehnert G. Sister chromatid exchange and chromosomal breakage in pentachlorophenol (PCP) exposed workers [J]. International Archives of Occupational and Environmental Health, 1987,59(4):413-417.

[8] Seiler J P. Pentachlorophenol [J]. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, 1991,257:27-47.

[9] Alex T. Proudfoot pentachlorophenol poisoning [J]. Toxicological Reviews, 2003,22(1):3-11.

[10] 王劍偉.稀有鮈鯽產卵頻次和卵子發育的研究 [J]. 水生生物學報, 1999,23:161-166.

[11] 李 莉,馬陶武,吳振斌.生活污水對稀有鮈鯽的毒性效應研究[J]. 水生生物學報, 2004,28:40-44.

[12] Frenzilli G. Nigro M. Lyons B P. The comet assay for theevaluation of genotoxic impact in aquatic environments [J]. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 2008,681(1): 80-92.

[13] 衛 東.用彗星試驗檢測烷基酚對海洋生物血淋巴細胞的DNA損傷 [D]. 青島:中國海洋大學, 2006.

[14] Krzysztof K, Anna L, Anna B, et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay [J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2003,534:15-20.

[15] Pavlica M, Klobular G I V, Mojas N, et al. Detection of DNA damage in haemocytes of zebra mussel using comet assay [J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2001,490:209-214.

[16] Pavlica M, Klobular G I V, Vetma N, et al. Detection of micronuclei inhaemocytes of zebra mussel and greatramshorn snail exposed to pentachlorophenol [J]. Mutation Research/ Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2000,465: 145-150.

[17] Villela I V, De Oliveira I M, Da Silva J, et al. DNA damage and repair in haemolymph cells of golden mussel (Limnoperna fortunei) exposed to environmental contaminants [J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2006,605:78-86.

[18] Roszell L E, Andersson R S. Effect of in vivo pentachlorophenol exposure on Fundulus heteroclitus phagocytes-modulation of bactericidal activity [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 1996, 26(3):205-211.

[19] Wilson J T, Pascoe P L, Parry J M, et al. Evaluation of the comet assay as method for the detection of DNA damage in the cells of a marine invertebrate, Mytilus edulis (Molusca:Pelecypoda) [J]. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 1998,339:197-210.

[20] Sai-Kato K, Umemura T, Takagi A, et al. Pentachlorophenolinduced oxidative DNA damage in mouse liver and protective effect of antioxidants [J]. Food and Chemical Toxicology, 1995, 33(10):877-882.

[21] Dong Y L, Zhou P J, Jiang S Y, et al. Induction of oxidative stress and apoptosis by pentachlorophenol in primary cultures of Carassius carassius hepatocytes [J]. Comparative Biochemistry and Physiology (Part C), 2009,150:179-185.

[22] Tugiyono, Gagnon M M. Metabolic disturbances in fish exposed to sodium pentachlorophenate (NaPCP) and 3, 3, 4, 4, 5-pentachlorobiphenyl (PCB126), individually or combined [J]. Comparative Biochemistry and Physiology (Part C), 2002,132: 425-435.

Alkaline single cell gel electrophoresis assay (SCGE) based study on DNA damage of Gobiocypris rarus induced by pentachlorophenol.

MA Yong-peng1, WANG Yan1, ZHU Xiang-wei2, LIU Shu-shen2, LIU Yan1?

(1.Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2.Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2010,30(2)：269～274

X171.5

A

1000-6923(2010)02-0269-06

2009-06-22

三峽庫區生態環境教育部重點實驗室科學研究基金項目(EF200606);全國優秀博士學位論文作者基金項目(200355);重慶市科委自然科學基金項目(CSTC,2009BB1131)

* 責任作者, 教授, liuyan@swu.edu.cn

馬永鵬(1985-),男,山東臨沂人,西南大學生命科學學院碩士研究生,研究方向為生物化學與分子生物學.發表論文1篇.