側孢短芽胞桿菌產生線蟲侵染性蛋白酶的優化

柯崇榕,黃 薇,秦 勇,田寶玉,黃建忠

(福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心生命科學學院福建省現代發酵技術工程研究中心,福建福州 350108)

側孢短芽胞桿菌產生線蟲侵染性蛋白酶的優化

柯崇榕,黃 薇,秦 勇,田寶玉,黃建忠＊

(福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心生命科學學院福建省現代發酵技術工程研究中心,福建福州 350108)

采用單因素試驗確定側孢短芽胞桿菌G4產線蟲侵染性蛋白酶的最佳碳氮源,通過Placket-Bur man設計篩選影響蛋白酶活力的主效因子,最陡坡試驗和Box-Behnken設計獲得主效因子的最佳水平,建立線蟲侵染性蛋白酶的最佳生產體系:葡萄糖9.78 g/L、牛肉膏16.65 g/L、磷酸氫二鉀0.75 g/L、可溶性淀粉12.5 g/ L、氯化鈉0.75 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、初始pH值自然、裝液量50 mL,37℃搖瓶培養32 h,蛋白酶活力可達12379.41 U/mL,較優化前的2476.3 U/mL提高了4倍。

侵染線蟲;蛋白酶;側孢短芽胞桿菌;響應面;優化

植物寄生線蟲是農業重要病害之一,全世界每年由于植物寄生線蟲病害所引起的農作物經濟損失達到1000億美元,嚴重制約了農業生產的良好發展[1]。由于對環境的破壞以及對人畜安全性的影響,目前使用的化學防治正逐步受到限制。具有環境友好性和無耐藥性的線蟲生物防治日顯迫切和重要[2]。目前,以生長快速、易于培養的食線蟲細菌為基礎的天然活菌劑正逐步成為新的研究熱點[3]。側孢短芽胞桿菌(B.laterosporus)G4具有很強的殺線蟲活性,可以有效地殺死松材線蟲和腐生線蟲[4]。B.laterosporusG4殺線蟲活性是由其胞外蛋白酶的高活力引起的。顯微觀察、電鏡觀察并結合化學免疫熒光觀察表明B.laterosporusG4分泌的蛋白酶通過對線蟲體壁的降解和破壞來殺死線蟲,并且線蟲侵染活性與蛋白酶活力成正相關[5-6]。本研究通過單因素試驗結合響應面優化設計,對影響B.laterosporusG4分泌蛋白酶的因素進行優化使其提高分泌蛋白酶的活力,為提高B.laterosporusG4的線蟲侵染能力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 側孢短芽胞桿菌Bacillus laterosporusG4產線蟲侵染性蛋白酶,由云南大學張克勤教授惠贈。

1.1.2 培養基(g/L) ①種子培養基:胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 5;②發酵初始培養基:葡萄糖10,酵母膏10,NaCl 0.4,K2HPO40.03, MgSO40.02。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶活力測定 蛋白酶活力采用國標SB/T10317-1999測定,酶活定義:在50℃,pH 10.0的條件下,每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸,所需的酶量為一個酶活力單位(I U)。

1.2.2 單因素輪換設計 以初始發酵培養基為基礎,采用單因素試驗初篩最適的碳氮源。分別以蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、硫酸銨、酵母浸出物、胰蛋白胨為氮源,在37℃、220 r/min條件下培養32 h,分析最佳氮源;在最佳氮源基礎上分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精為碳源,篩選最佳碳源。

1.2.3 Plackett-Burrman(PB)設計 以單因素試驗所確定的最佳碳氮源為碳氮源的初始發酵培養基為基礎,選用9個因素、試驗次數為12、重復次數為2次的Plackett-Burrman試驗設計,考察影響蛋白酶活力的主效應因素及其各因素之間的一級交互作用,篩選G4產線蟲侵染性蛋白酶的重要因素。

1.2.4 響應面設計 根據PB設計篩選出3個主要影響因素效應值的正負及其大小設計各主要影響因素的爬坡方向和步長,進行最陡爬坡試驗,以逼近最大產酶區域,建立有效的擬合方程。以最佳的爬坡試驗條件組為水平中心點,根據Box-Behnken設計原理,進行3因素3水平15個試驗點的響應面試驗分析。

1.2.5 統計分析 采用統計分析軟件SAS 9.2和DPS 7.05對試驗結果數據進行分析統計。

2 結果與分析

2.1 線蟲侵染性蛋白酶活力分析

利用Folin-酚法測定蛋白酶活力,繪制B.laterosporusG4線蟲侵染性蛋白酶活力曲線,見圖1。結果表明,G4培養32 h,菌體處于穩定期,蛋白酶活力最高可達2476.3 U/mL。

圖1 側孢短芽胞桿菌G4的侵染性蛋白酶活力曲線Fig.1 Protease activity curve of B.laterosporusG4

2.2 最適碳氮源的篩選

以發酵初始培養基為基礎,考察不同碳氮源(10 g/L)對G4產線蟲侵染性蛋白酶的影響,見圖2和圖3。從圖2、圖3中可以看出,G4在以牛肉膏為氮源,可溶性淀粉為碳源的培養基體系中蛋白酶活力最高,可達8963.46 U/mL。

圖2 不同氮源對蛋白酶活力的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on producing protease

2.3 Plackett-Burman試驗設計

根據單因素的優化結果,選擇葡萄糖、牛肉膏、可溶性淀粉、NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4和CaCl2作為優化輸入因子,蛋白酶活力為響應值,進行Plackett-Burr man(N=12)設計,見表1。

圖3 不同碳源對蛋白酶活力的影響Fig.3 Effects of carbon sources on producing protease

表1 Plackett-Burman試驗設計響應值Table 1 Experimental response of Plackett-Burman

通過SAS 9.2進行數據處理和因素主效應分析,見表2。從表2可以看出,牛肉膏X2對蛋白酶活力的影響最大(P＜0.01,極顯著),其次為葡萄糖X1(P＜0.05)、磷酸氫二鉀X6(P＜0.05)和硫酸鎂X7(P＜0.05),其他因素對蛋白酶活力影響不顯著。牛肉膏X2、硫酸鎂X7和硫酸銨X8表現為正作用,其他變量表現為負作用。一階優化試驗模型F檢驗為0.035972＜0.05,可信度超過95%。

表2 Plackett-Burman試驗設計方差分析表Table 2 Analysis of variance for Plackett-Bur man design

2.4 響應面試驗設計

根據PB試驗一階優化結果,以牛肉膏、葡萄糖和K2HPO43個因素為主效因子進行響應面試驗設計二階優化。

2.4.1 最陡坡試驗 最陡坡試驗因子為PB試驗設計中表現為顯著性的因子(P＜0.05)。因子變化的方向和步長由一次多元線性編碼方程中的變量系數確定,其正負確定變量的增減方向,其大小決定步長的長短,見表3。

表3 最陡爬坡試驗設計及其結果Table 3 Results and experimental design of Stee Pest Ascent Search

2.4.2 Box-Behnken設計試驗 根據最陡爬坡試驗,選取第2組試驗點作為中心點進行BOX-Behnken二階優化,借助SAS 9.2軟件輔助進行試驗設計、數據統計與擬合分析見表4,根據BOXBehnken試驗設計模型推出二次多元相互作用的擬合回歸方程:Y1=17667.9+3.713292X1+從表4可以看出,回歸方程具有較好的擬合度。

表4 BOX-Behnken設計矩陣和響應數據的實測值與擬合值Table 4 Test scheme and its observation and simulation values in BOX-Behnken design

2.4.3 二次響應面回歸模型的建立 二次響應面回歸(RSREG)分析,見表5。

表5 BOX-Behnken設計回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance in predictive model for BOX-Behnken design

分析表明,牛肉膏和K2HPO4及其相互作用對蛋白酶活力的影響最大,均呈顯著水平(P＜0.05)?？偰Ｐ突貧w顯著性檢驗P值=0.0014546,擬合不足顯著性檢驗P值=0.0053296,說明模型回歸極顯著,失擬極不顯著,擬合方程式可靠;方差分析顯示方程的線性回歸和二次回歸極顯著(P＜0.01),交叉項回歸顯著(P＜0.05)。因此,該模型可以用于B.laterosporusG4產枯草桿菌蛋白酶發酵優化的理論預測。

預測模型的典型相關分析和嵴嶺分析表明,模型的響應面為馬鞍面(存在2個以上的最大值),使用嵴嶺分析在優化區附近尋優分析。嵴嶺分析預測模型響應面的最大值為11563.09 U/ mL,相應的優化因子水平葡萄糖、牛肉膏和K2HPO4分別為9.7817、16.6503、0.7471 g/L。

2.5 最優發酵配方組合的驗證

對預測的響應面的最大值在同等條件下進行驗證,3次重復驗證試驗的平均酶活為11563.09 U/mL。回歸分析見表6。

表6 t測驗驗證預測值與觀測值的差異Table 6 Difference between predicted value and observational value byttest

表6表明,在95%置信范圍內,觀測值的平均值與預測值相近,差異不顯著(P=0.0473),可見該響應面模型較好地預測了試驗結果。應用響應面優化B.laterosporus G4的液體發酵生產線蟲侵染性蛋白酶是可行有效的。優化從最初酶活力為2476.3 U/mL提高至12379.41 U/mL,提高了4倍。

3 討 論

本試驗通過單因素試驗獲得可溶性淀粉和牛肉膏為最佳碳氮源;采用Plackett-Burman試驗確定牛肉膏、葡萄糖、K2HPO4為3個主效影響因子;在此基礎上通過最陡坡試驗,確定最佳響應區域;采用中心組合設計和SAS 9.2軟件分析,獲得最佳發酵體系:初始pH值自然、裝液量50 mL、葡萄糖9.7817 g/L、牛肉膏16.6503 g/L、K2HPO40.7471 g/L、可溶性淀粉12.5 g/L、氯化鈉0.75 g/L和硫酸鎂0.5 g/L。在此試驗條件下,B.laterosporus G4產生的線蟲侵染性蛋白酶活力可達12376 U/mL,比優化前提高了400%。

[1]Barker K R.Introduction and synopsis of advancements in nematology[M].Madison,W is.(USA):American Society of Agronomy,1998:1-25.

[2]Dong L,Zhang K.Microbial control of plant-parasitic nematodes:a five-party interaction[J].Plant and Soil,2006,288 (1):31-45.

[3]Tian B,YangJ,Zhang KQ.Bacteria used in the biological control of plant-parasitic nematodes:populations,mechanis ms of action,and future prospects[J].FEMS microbiology ecology, 2007,61(2):197-213.

[4]Tian B,Yang J,Lian L,et al.Role of an extracellular neutral protease in infection against nematodes by Brevibacillus laterosporus strain G4[J].Applied microbiology and biotechnology, 2007,74(2):372-380.

[5]Tian B,Ke C,Huang W,et al.Direct visualization of bacterial infection process in nematode hosts by an improved immunocytochemical method[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25(6):1175-1179.

[6]Huang X,Tian B,Niu Q,et al.An extracellular protease from Brevibacillus laterosporus G4 without parasporal crystals can serve as a pathogenic factor in infection of nematodes[J].Research in microbiology,2005,156(5-6):719-727.

Optimization of Nematode Infection-Oriented Protease Production by Bacillus laterosporus

KE Chong-rong,HUANG Wei,QIN Yong,TIAN Bao-yu,HUANG Jian-zhong
(Engin.Res.Ctr.of Indust.Microbiol.,Ministry of Educ.,Coll.of Life Sci., Engin.Res.Ctr.of Fujian Modern Ferment.Technol.,Fujian Normal Uni.,Fuzhou350108)

Single-factor experiments were used to screen the optimum carbon and nitrogen sources for Bacillus laterosporus G4 to produce nematode infection-oriented protease(N I OP).The main effective factors on protease production were screened by Plackett-Burrman design.Then,the path of the steepest ascent and Box-Behnken design was utilized to obtain the optimal level of the main effective factors and established N I OP production system.They were:glucose 9.78 g/L,beef extract 16.65 g/L,K2HPO40.75 g/L,soluble starch 12.5 g/L,NaCl 0.75 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L at natural initial pH with 50 ml of filling volume and cultured in 32℃,250 r/min for32 h.The protease activity of Bacillus laterosporusG4 was as high as 12379.41 U/mL increased by 4 times as compared with 2476.3 U/ mL of the one before the optimization.

infection of nematode;protease;Bacillus laterosporus;RS M;optimization

TQ92

A

1005-7021(2010)06-0006-05

國家自然科學基金(30800735);福建省杰出青年科學基金(2009J06014)

柯崇榕 男,助理實驗師。主要從事工業酶制劑的研究開發。E-mail:kechr@fjnu.edu.cn

＊通訊作者。Tel:0591-22868212,E-mail:hjz@fjnu.edu.cn

2010-11-10;

2010-11-20